Mise en évidence de la protection du chorion par l'extrait ginkgo flavone-glycosides haute concentration dans un modèle de gencive maintenue en survie et altérée

Introduction

Le pouvoir pathogène des bactéries de la plaque dentaire se traduit par la libération de plusieurs enzymes (hyaluronidases, chondroïtine sulfatases, collagénases, élastases) ^{(Kitawaki et coll., 1983)}, de cytotoxines ^{(Charon et coll., 1982)} et d'endotoxines bactériennes (lipopolysaccharides) ^{(Tzamouramis et coll., 1979)}. Parallèlement, l'agression bactérienne a pour conséquence une réponse inflammatoire avec afflux des cellules immunitaires de l'hôte qui vont, elles aussi, libérer non seulement des enzymes protéolytiques, comme l'élastase leucocytaire libérée par les polynucléaires neutrophiles ^{(Damiano et coll., 1988} ; ^{Weiss, 1989)}, mais également produire des radicaux libres à pouvoir bactéricide. Ces deux phénomènes ont pour conséquence une destruction importante du chorion gingival ^{(Goodson et coll., 1982} ; ^{Bowers et coll., 1989)} : dépolymérisation des collagènes, fragmentation et destruction de l'élastine, de l'acide hyaluronique, rupture de molécules entraînant des inactivations enzymatiques, des produits toxiques ou la formation d'agrégats protéiques.

Afin d'analyser l'efficacité de principes actifs permettant de traiter ces différents phénomènes, il a été développé un modèle de gencive, maintenue en survie par culture d'organe, sur lequel ont été simulées artificiellement des altérations du tissu conjonctif ^{(Boisnic et coll., 1997a)}. Les altérations des fibres élastiques et du collagène ont été réalisées par irritation enzymatique, à l'aide de l'élastase leucocytaire humaine (retrouvée dans les poches parodontales), ou physique, avec des irradiations UV induisant la génération de radicaux libres dans le chorion ^{(Boisnic et coll., 1997b)}. L'étude a été histologique et morphométrique par analyse d'image informatisée.

De nombreux travaux scientifiques ont démontré l'action d'un extrait de ginkgo biloba spécifique et breveté, EGb 761 (Beaufour Ipsen), sur la capture de différents radicaux libres, et particulièrement du plus dangereux d'entre eux, le radical hydroxyl ^{(Marcocci et coll., 1994a}, ^b ; ^{Maitra et coll., 1995)}. L'extrait déterpéné GFGHC (Bioscreen SA) possède une activité anti-radicalaire deux fois plus puissante (travaux non publiés, Bioscreen SA). Quant aux céramides d'origine végétale, ce sont des analogues des céramides endogènes trouvées essentiellement au niveau de l'épiderme et des membranes cellulaires. Ce sont des glycosphingolipides, constitués d'un corps sphingoïde, appelé phytosphingosine, associé à un acide gras par N-acétylation ^{(Wertz et Downing, 1982} ; ^{Hakomori, 1990} ; ^{Hannun, 1994)}. ^{Bizot-Foulon et coll. (1996)} ont montré une activité inhibitrice de l'ELH. L'objectif de ce travail a été d'analyser, sur le modèle de gencive maintenue en survie et altérée, l'effet préventif d'un gel associant l'extrait ginkgo flavone-glycosides haute concentration (GFGHC) et des céramides d'origine végétale vis-à-vis de la destruction du tissu conjonctif par l'ELH ou les radicaux libres.

Matériel et méthodes

Préparation des gencives humaines maintenues en survie

Une méthode de culture permettant la mise en survie d'un fragment de muqueuse buccale humaine normale a été développée. Cette méthode a été mise au point en utilisant de précédents travaux concernant le maintien en survie de fragments de peau ^{(Chapman et coll., 1989} ; ^{Kondo et coll., 1990} ; ^{Boisnic et coll., 1997a)}.

Dix fragments de muqueuses gingivales humaines normales (gencive papillaire) sont obtenus dans la consultation de stomatologie après avulsions dentaires. Transportées dans une compresse imbibée de sérum physiologique, les muqueuses gingivales sont coupées en plusieurs morceaux (fragment témoin, fragments irrités par l'ELH, fragments irrités par les UV). Chaque fragment de gencive est rapidement déposé côté chorion contre la membrane poreuse d'un insert (nacelle de 12 mm de diamètre avec membrane en polycarbonate de porosité 0,45 µm, Costar), lui-même positionné sur un puits de culture (plaque 12 puits, Costar). L'épithélium est en contact avec l'air libre. L'ensemble est maintenu en survie pendant 20 jours à 37 °C et en atmosphère air/CO₂ (95 %/5 %). Du milieu de culture (milieu essentiel minimum modifié Dulbecco ; Gibco BRL, USA) enrichi en antibiotiques (100 µg/ml pénicilline, 100 µg/ml streptomycine ; Gibco BRL, USA), hormones (Sigma, France), extrait pituitaire bovin (Gibco BRL, USA) et SVF (DAP, France) est déposé dans le fond des puits, un passage s'effectuant par diffusion lente entre les deux compartiments vers le chorion par l'intermédiaire de la membrane poreuse. Ce milieu de survie est renouvelé trois fois par semaine.

Réalisation des altérations gingivales

Altérations des fibres élastiques par l'ELH

Les fibres élastiques ont été altérées enzymatiquement par de l'élastase leucocytaire humaine (EPC, USA) déposée sur l'épithélium de chaque fragment de gencive ^{(Wallach et Hornebeck, 1989)} ; pour cela, 10 µg/ml d'ELH sont déposés trois fois par semaine.

Altérations des fibres élastiques et du collagène obtenues après irradiations UV A et B

Des altérations expérimentales des fibres élastiques et du collagène ont été réalisées par irradiation UV selon un protocole établi pour la peau humaine maintenue en survie ^{(Boisnic et coll., 1997b)}. A cette fin, les gencives maintenues en survie sont irradiées par 12 J/cm² en UV A puis par 6 J/cm² en UV B à l'aide d'une lampe Vilber Lourmat (France). La source UV B est constituée de trois tubes à vapeur de mercure T-20M-312 (pas d'émission UV A ni UV C) et la source UV A est constituée de trois tubes T-20L-365 (pas d'émission UV B ni UV C) permettant d'obtenir rapidement des altérations du collagène et des fibres élastiques. Les doses délivrées sont contrôlées par un radiomètre RMX-365/312 équipé d'un ordinateur délivrant l'énergie en mJ/cm² sur la base de 6 mesures par seconde. Six séances d'exposition sont effectuées (soit deux par semaine), les échantillons étant placés à 30 cm de la source UV.

Application des produits

Il s'agit d'un gel associant l'extrait ginkgo flavone-glycosides haute concentration à 0,3 % (Bioscreen SA) et des céramides d'origine végétale à 0,1 % (Laboratoire Inocosm).

Le gel a été appliqué trois fois par semaine au niveau de la muqueuse gingivale au moment des changements de milieu, en même temps que les applications d'ELH ou juste après les séances d'irradiation.

Analyse histologique et morphométrique des altérations du chorion

Au terme des 20 jours de culture, les fragments de gencive sont prélevés, fixés dans le liquide de Bouin et inclus en paraffine. Une coloration par l'hémalun-éosine est réalisée sur des coupes de 4 µm d'épaisseur pour une étude histologique.

L'analyse d'image informatisée permet de quantifier histologiquement les fibres élastiques colorées par la (+) catéchine ^{(Godeau, 1984} ; ^{Wallach et Hornebeck, 1989)} et les collagènes fibrillaires (principalement les collagènes de type I et III) par le rouge Sirius ^{(Lopez de Leon et Rojkind, 1985)}. Les coupes histologiques sont placées sur une platine de microscope connectée à une caméra. L'image saisie par la caméra vidéo est analysée dans un ordinateur programmé pour réaliser différentes mesures.

Le programme d'étude des fibres élastiques permet de calculer les paramètres suivants :

- pourcentage de surface occupée par les fibres élastiques du chorion ;

- mesure de la fibre la plus longue (µm) pour les fibres élastiques.

Le programme d'étude du collagène permet de mesurer le pourcentage de surface occupée par celui-ci dans le chorion.

Statistiques

Une analyse statistique des résultats a été réalisée (test de Student) avec un risque alpha de première espèce fixé à 0,05.

Résultats

Analyse histologique après coloration par l'hémalun-éosine

L'analyse au microscope optique des coupes histologiques colorées par l'hémalun-éosine permet de visualiser les altérations du chorion obtenues après irradiation par les UV A et B ou après application d'ELH. Quelle que soit la technique d'altération utilisée, les modifications du tissu conjonctif gingival sont similaires : d'importants remaniements Ïdémateux sont observés dans le chorion, se traduisant par une augmentation d'espaces optiquement vides. L'œdème prédomine sur certains plans de coupe au contact de capillaires dilatés, avec parfois présence d'une extravasation d'éléments inflammatoires lymphocytaires et de mastocytes mis en évidence par le bleu de toluidine. Au niveau des gencives témoins maintenues en survie, aucun phénomène œdémateux n'a été observé.

Analyse histologique et morphométrique des fibres élastiques

Au niveau des gencives témoins maintenues en survie pendant 20 jours, les fibres élastiques colorées par la (+) catéchine apparaissent normales (^{fig. 1}) : au niveau du chorion superficiel, de fines fibres élastiques montent dans les papilles gingivales ; dans le chorion plus profond, on trouve enfin des fibres élastiques matures plus nombreuses, plus longues et plus épaisses ^{(Chavrier, 1990} ; ^{Bonnaure-Mallet, 1991)}.

Les altérations des fibres élastiques obtenues après irradiation par les UV A et B ou après application d'ELH sont similaires (^{tableau I}) : on observe une diminution histologique du nombre de fibres élastiques du chorion, avec parfois disparition totale. L'évaluation morphométrique confirme ce résultat. En effet, après irradiation par les UV A et B, est observée une diminution statistiquement significative (p < 0,05) par rapport aux gencives témoins de la surface occupée par les fibres élastiques dans le chorion : 4 % versus 10,25 %. Après action enzymatique de l'ELH, la surface occupée par les fibres élastiques n'était plus que de 4,3 % (^{fig. 2}).

On note par ailleurs, mais uniquement après irradiation, une importante fragmentation des fibres élastiques restantes. L'analyse d'image met en évidence ce phénomène de fragmentation : les fibres élastiques ont une longueur maximale de 14,7 µm, significativement différente de celle mesurée au niveau des gencives témoins : 43 µm dans le chorion (p < 0,05 ; test de Student).

Après application du gel associant l'extrait GFGHC et CV, une protection des fibres élastiques vis-à-vis de la destruction par les irradiations UV et par l'ELH (^{fig. 3}) est obtenue : histologiquement, la surface occupée par les fibres élastiques est significativement plus importante que celle mesurée sur les gencives uniquement irradiées ou détruites par l'ELH, respectivement 8,1 % et 8, 3 % versus 4 % et 4,3 % (p < 0, 05). Ce résultat témoigne de la protection des fibres élastiques d'environ 40 % grâce à l'application du gel associant l'extrait GFGHC à 0,3 % et les CV à 0,1 %.

Après irradiations UV puis traitement par le gel, les fibres élastiques sont significativement beaucoup moins fragmentées que les fibres élastiques observées au niveau des gencives irradiées, ce qui montre, là encore, l'effet protecteur du gel vis-à-vis des effets délétères des UV (p < 0, 05).

Évaluation histologique et morphométrique du collagène

La coloration des coupes histologiques par le rouge sirius a permis d'analyser l'organisation des faisceaux de collagène de type I et III, leurs éventuelles altérations.

Au niveau des gencives témoins maintenues en survie pendant 20 jours, aucune altération des faisceaux de collagène n'est observée. On peut noter l'intensité de la coloration par le rouge sirius comme étant le témoin de la parfaite conservation du collagène ; l'épaisseur des faisceaux est normale ainsi que leur organisation. Le pourcentage de surface du chorion occupée par les collagènes fibrillaires représente 93 % (^{fig. 4}) (^{tableau II}), résultat attendu puisque les collagènes de types I et III représentent la portion majoritaire du tissu conjonctif gingival ^{(Ballard et Butler, 1974)}.

Après irradiation par les UV A et B, on observe d'importantes altérations des faisceaux de collagène avec amincissement de ceux-ci et désorganisation (^{fig. 5}). Il en résulte une diminution de l'intensité de la coloration histologique par le rouge sirius. La quantité de collagène mesurée dans le chorion n'est plus que de 72 %, soit une baisse significative (p < 0,05 ; test de Student) de 22 % par rapport aux gencives témoins.

Après application du gel contenant l'association GFGHC et CV, une protection très importante du collagène fibrillaire vis-à-vis de la destruction par les irradiations UV (^{fig. 6}) est obtenue. En effet, histologiquement, il n'a pas été noté de désorganisation ni d'amincissement de ces faisceaux de collagène. Le pourcentage de surface de collagène mesurée est identique à celui obtenu au niveau des gencives témoins : 90 % (pas de différence significative entre gencives traitées et gencives témoins) et est supérieur à celui obtenu après irradiation seule (p < 0, 05).

Discussion

Dans les gingivites non spécifiques associées à la présence de la plaque dentaire, un taux élevé d'élastase leucocytaire, principalement sécrétée par les polynucléaires neutrophiles, est considéré comme un signe d'activité inflammatoire. Par ailleurs, cette enzyme s'avère capable de dégrader non seulement son substrat préférentiel, l'élastine, mais également d'autres macromolécules du tissu conjonctif telles que le collagène, les glycoprotéines de structure, les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes ^{(Robert et Hornebeck, 1989)}. Il en résulte une destruction du tissu parodontal. L'inhibition de cette enzyme est donc recherchée pour le traitement des gingivites ^{(Pitaru et coll., 1994)}.

Des radicaux libres sont également incriminés dans la destruction du tissu de soutien de la gencive, c'est-à-dire le collagène et les fibres élastiques. Ces radicaux libres sont produits par les bactéries de la plaque dentaire, d'une part, et sont également produits par les polynucléaires neutrophiles (notamment l'anion superoxyde). Là encore, l'inhibition de la production de radicaux libres est recherchée pour le traitement de la gingivite associée à la plaque dentaire.

Afin d'étudier l'efficacité de principes actifs visant à limiter les destructions du tissu conjonctif au cours de la gingivite, est mis au point un modèle de gencive irritée par des processus chimiques et physiques sur des fragments de gencive normale maintenus en survie pendant 20 jours selon un protocole défini pour la peau ^{(Boisnic et coll., 1997a)}. La destruction des fibres élastiques et du collagène par l'ELH mime celle générée in vivo par l'élastase des polynucléaires et/ou des bactéries. Quant à la destruction des fibres élastiques et du collagène par les irradiations UV ^{(Boisnic et coll., 1997b)}, notre modèle reproduit la théorie des radicaux libres dans les gingivites. Ce modèle original a permis de mettre en évidence et de quantifier l'activité protectrice de l'association GFGHC et CV vis-à-vis des altérations de deux macromolécules, les fibres élastiques et le collagène.

Une étude préliminaire (travaux non publiés ; Laboratoire Bioscreen) avait permis de mettre en évidence l'activité anti-élastasique de l'extrait GFGHC à différentes concentrations. Pour cela, un modèle d'altération des fibres élastiques par l'ELH (10 µg/ml) avait été réalisé sur des coupes histologiques de gencives humaines. L'application de l'extrait GFGHC à 0,3 % en même temps que l'ELH a permis une protection des fibres élastiques matures de l'ordre de 33 %. Bien que le mécanisme d'action de l'activité anti-élastasique de cet extrait n'ait pas été élucidé, il semble malgré tout agir comme un inhibiteur direct de l'ELH.

Dans ce même modèle, les CV à 0,1 % étaient capables de protéger 15 % des fibres élastiques contre l'élastolyse induite par l'ELH. L'élastase leucocytaire humaine est une sérine-protéase comportant dans sa structure une poche hydrophobe pouvant lier des molécules telles que les acides gras ou des mucopolysaccharides, inhibant ainsi son activité. Or, les CV possèdent des chaînes d'acide gras polyinsaturés ainsi qu'un groupement hydroxyl en position 4 capable de se fixer dans la poche hydrophobe de l'enzyme. Dans un modèle de gencive de rat inflammée, il a été montré que les céramides végétales inhibaient l'élastase en se fixant sur l'enzyme et non pas en se fixant sur son substrat, l'élastine ^{(Bizot-Foulon et coll., 1996)}.

Enfin, une analyse supplémentaire a permis de montrer que l'application simultanée de GFGHC et de CV à 0,1 % potentialisaient la protection obtenue avec l'extrait GFGHC seul. C'est la raison pour laquelle ces deux types de molécule ont été associés pour réaliser un gel à appliquer dans notre modèle de gencive altérée expérimentalement. Les résultats obtenus avec ce modèle de gencive altérée confortent ceux obtenus dans l'étude préliminaire sur coupes de gencives fraîches : 40 % des fibres élastiques et 90 % du collagène du chorion sont protégés de la destruction par l'ELH après application de l'association entre l'extrait GFGHC à 0,3 % et les CV à 0,1 %.

En ce qui concerne le mécanisme de protection du collagène par le gel associant GFGHC et CV vis-à-vis des effets délétères des UV ou de l'ELH, il semblerait qu'elle soit due à la fixation de l'extrait GFGHC par sa fraction flavonoïdique sur les fibres de collagène ^{(Herbage et coll., 1989}, ¹⁹⁹¹⁾. Ces études ont montré que l'extrait de ginkgo biloba augmentait la fibrillogenèse (essai en tube à partir de fibres de collagène en solution). Par ailleurs, les UV génèrent des radicaux libres susceptibles de détruire les molécules de collagène. Or les extraits de ginkgo biloba sont des capteurs de radicaux libres très efficaces grâce à leur fraction flavonoïdique ^{(Pincemail et coll., 1985}, ¹⁹⁸⁹, ¹⁹⁹⁰ ; ^{Gardès-Albert et coll., 1990)}. Il est donc probable que l'extrait GFGHC ait également ce rôle de capteur de radicaux libres dès leur formation par les UV, expliquant la protection du collagène vis-à-vis de sa destruction par les radicaux libres. Le maintien en survie de fragments de gencive humaine et la réalisation d'une irritation gingivale par application d'UV ou d'ELH est un modèle qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé in vivo lors de gingivite associée à la plaque dentaire. De nombreuses biopsies chez les patients peuvent être évitées ainsi que des protocoles réalisés chez les animaux. On a pu montrer ainsi l'effet protecteur du tissu conjonctif parodontal par un gel associant l'extrait GFGHC à 0,3 % et des CV à 0,1 % vis-à-vis d'altérations induites par l'ELH et les UV.

Demande de tirés à part

Sylvie de Stomatologie et de Chirurgie maxillo-facile, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière 47-83, boulevard de l'Hôpital, 75073 PARIS - FRANCE.

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