Quel est l'impact réel de l'association d'un agent anionique (dioctylsulfosuccinate de sodium) sur l'activité bactéricide du digluconate de chlorhexidine ?

Introduction

La chlorhexidine est un agent dicationique dont l'activité antiseptique est largement reconnue (^{Stanley et al., 1989} ; ^{Luc et al., 1991} ; ^{Mengistu et al., 1999}), particulièrement dans le domaine bucco-dentaire (^{De la Rossa et al., 1988} ; ^{Mandel, 1988} ; ^{Banting et al., 1989} ; ^{Brecx et al., 1993} ; ^{Addy et Wade, 1995} ; ^{Netuschil et al., 1995}). Cependant, la mise en forme pharmaceutique de ce type de composé est sujette à controverse. En effet, si l'association à d'autres agents cationiques, de même qu'aux alcools, est possible, voire bénéfique, par augmentation de la solubilité et de l'activité antimicrobienne, celle avec les halogénés, les aldéhydes et les dérivés anioniques est considérée comme défavorable (^{Barkvoll et al., 1988} et ¹⁹⁸⁹ ; ^{Reverdy, 1995}). Cependant, comme le souligne ^{Reverdy (1995)}, l'adaptation des concentrations au niveau des préparations commerciales peut permettre la validation de certaines associations. Actuellement, est commercialisé en France, un bain de bouche contenant 0,10 % de digluconate de chlorhexidine et un agent anionique, le dioctylsulfosuccinate de sodium (DOSSNa) à 0,10 %. Se fondant sur l'association cationique/anionique et sur le faible effet chromogène de ce bain de bouche, certains auteurs émettent l'hypothèse d'une inactivation partielle de la chlorhexidine au sein de cette formulation (^{Addy et Wade, 1995} ; ^{Harper et al., 1995}). Cependant, les travaux réalisés sur l'évaluation de l'activité antiseptique du produit fini démontrent une activité bactéricide supérieure à celle d'une solution aqueuse à 0,10 % de digluconate de chlorhexidine (^{Luc et al., 1998}), soutenant le rôle essentiel des excipients dans l'optimisation globale d'une formulation.

Cette étude évalue les interactions, en termes d'activité bactéricide, entre le digluconate de chlorhexidine à 0,10 % et le DOSSNa à la concentration utilisée (0,10 %) et à une concentration supérieure (1 %) versus le bain de bouche commercialisé.

Matériel et méthode

Produits et solutions d'essai

Des solutions aqueuses contenant 0,10 % de digluconate de chlorhexidine (CHX, Sigma), seul ou associé à 0,10 et 1 % de dioctylsulfosuccinate de sodium (DOSSNa, IRPF, Castres) en concentration finale, sont préparées extemporanément. Le bain de bouche de référence contenant 0,10 % de digluconate de chlorhexidine en tant que principe actif antiseptique et 0,10 % de DOSSNa en tant qu'excipient a été testé dans les mêmes conditions. Selon l'activité intrinsèque des solutions, des dilutions supplémentaires sont réalisées avec de l'eau distillée stérile afin d'évaluer la perte d'activité bactéricide.

Souches bactériennes

Les souches utilisées proviennent de la collection de l'Institut Pasteur (Paris) et correspondent aux principaux groupes de micro-organismes rencontrés dans le domaine bucco-dentaire :

- souche bactérienne à Gram positif, Streptococcus mutans CIP 103220T ;

- souche bactérienne à Gram négatif capnophile, Capnocytophaga ochracea CIP 82101 ;

- souche bactérienne à Gram négatif anaérobie, Prevotella intermedia CIP 103607T.

Pour les souches anaérobies et microaérophiles, l'entretien est effectué sur gélose au sang de mouton (Biomérieux), avec des incubations de 48 à 72 heures à 37 °C, respectivement en incubateur anaérobie (N₂ 80 %, H₂ 10 %, CO₂ 10 %) ou sous atmosphère contenant 5 % de CO₂ (Generbag, Biomérieux). Les dénombrements sont réalisés en gélose Schaedler pour S. mutans et en gélose au sang de mouton pour les autres bactéries, selon les conditions d'incubation définies. Les suspensions bactériennes utilisées pour les essais ont été préparées extemporanément dans l'eau distillée stérile et ajustées à 10⁹ bactéries/ml pour C. ochracea et 10⁸ micro-organismes/ml pour les autres bactéries.

Méthode

L'activité bactéricide des solutions et de leurs dilutions a été déterminée selon la méthode par dilution-neutralisation décrite par les normes françaises (^{Afnor, 1989}) et européennes (^{Bloomfield et Looney, 1992}) concernant l'évaluation des antiseptiques et des désinfectants, pour un temps de contact de 1 minute à 32 °C. Les dénombrements des micro-organismes viables résiduels sont réalisés selon la technique des unités formant colonies (ufc), en utilisant les milieux de culture et les conditions d'incubation précédemment décrites, par étalement de 100 µl des dilutions pour C. ochracea et par incorporation de 1 ml des dilutions pour les autres micro-organismes. Les essais sont réalisés en double. Les résultats sont exprimés en logarithme décimal de réduction par rapport à l'inoculum initial. La limite supérieure considérée en réduction logarithmique est de 5 log, la limite inférieure est de 1 log.

Résultats

En ce qui concerne S. mutans, l'évaluation de l'interaction DOSSNa/CHX a pu être réalisée sur les solutions mères et le bain de bouche non dilués. Les résultats obtenus, en termes de réduction logarithmique, sont présentés dans le ^{tableau 1.} Le digluconate de chlorhexidine seul présente une activité bactéricide modérée vis-à-vis de S. mutans. L'ajout de DOSSNa se traduit par une augmentation de l'activité bactéricide, et ce aux 2 concentrations en DOSSNa testées. Le bain de bouche de référence induit, dans les mêmes conditions d'essai, une réduction de l' inoculum initial supérieure ou égale à 5 log.

En ce qui concerne C. ochracea, le ^{tableau 2} présente les résultats des réductions logarithmiques après contact avec les produits et leurs dilutions. Jusqu'à la dilution au 1/10 incluse, le digluconate de chlorhexidine à 0,10 % dans la solution mère induit des réductions logarithmiques supérieures ou égales à 5, que ce soit en présence de DOSSNa ou non. Pour la dilution au 1/25, un gain d'activité bactéricide comparable lors de l'association à 0,10 % et à 1 % de DOSSNa est noté. Cet effet positif de l'association est retrouvé au niveau du bain de bouche, puisque sont observées des réductions logarithmiques supérieures à celles constatées avec le digluconate de chlorhexidine seul à 0,10 % (dilution 1/25 : 3,8 log et 3 log respectivement). Lors des essais à la dilution 1/50, c'est l'association CHX 0,10 %/DOSSNa 0,10 % qui se révèle la plus efficace. À 1 % de DOSSNa, une disparition de l'effet positif de l'association est notée. Les résultats obtenus avec P. intermedia sont relativement similaires, avec des réductions logarithmiques supérieures à 5 pour les solutions contenant 0,10 % de chlorhexidine jusqu'à la dilution au 1/25 (^{tableau 3}) . Pour les dilutions supérieures, une augmentation notable de l'activité bactéricide est observée lorsque la CHX est associée à 0,10 % de DOSSNa, puisque les réductions passent de 1,5 log pour la chlorhexidine seule à 2,4 log pour le binaire. Ce phénomène est largement retrouvé au niveau du bain de bouche de référence, avec des réductions logarithmiques supérieures ou égales à 2, même après dilution au 1/100. Pour une concentration en DOSSNa de 1 %, est notée une diminution de l'activité bactéricide du binaire, y compris par rapport à la chlorhexidine seule, avec une réduction inférieure à 1 log après dilution au 1/100, soulignant un effet antagoniste à cette concentration.

Discussion

La nature cationique de la chlorhexidine est impliquée dans l'adsorption de la molécule aux surfaces orales et, secondairement, dans son activité antibactérienne rémanente (^{Jenkins et al., 1989}). Cette caractéristique serait également responsable de la formation de sels de faible solubilité avec des anions de type phosphate, sulfate et chlorure (^{Barkvoll et al., 1988} et ¹⁹⁸⁹). En termes de compatibilité, les premiers travaux d'^{Addy (1989)} démontrent que l'activité antimicrobienne de la chlorhexidine peut être conservée lors d'association à des détergents. Plus récemment, ^{Addy et Wade (1995)} ont mis en cause, dans les phénomènes de coloration des dents, l'interaction de la chlorhexidine avec les substances chromogènes issues de l'alimentation. Ce type d'interaction serait lié à la fonction cationique de la chlorhexidine et signerait son activité antibactérienne. Cependant, si la relation entre effet chromogène et maintien ou inactivation de la chlorhexidine a été démontrée pour des solutions aqueuses de chlorhexidine, il n'en est pas de même pour les formulations complexes. Les interactions mises en jeu entre principe(s) actif(s) et excipients sont donc souvent multifactorielles, à la fois physico-chimiques et biologiques, et peuvent, comme nous le notons ici, varier en fonction des concentrations et/ou de leur rapport. En fait, l'association chlorhexidine /composé anionique doit essentiellement prendre en compte l'évaluation de l'activité antimicrobienne des produits seuls et de l'association pour des rapports de concentrations définis, le type d'interaction observé pouvant évoluer en fonction de ceux-ci. Malgré la sensibilité à l'oxygène des micro-organismes bucco-dentaires testés, les essais de bactéricidie in vitro ont pu être réalisés et validés par dénombrement sur gélose des suspensions de travail.

Ainsi, pour une concentration de 0,10 % en DOSSNa, nos résultats démontrent une absence d'antagonisme avec le digluconate de chlorhexidine à 0,10 %. Un effet positif est même observé pour P. intermedia, C. ochracea et S. mutans. À 1 % de DOSSNa, une diminution de cet effet bénéfique peut apparaître (P. intermedia). Ces résultats ne sont alors pas contradictoires avec ceux de ^{Barkvoll et al. (1989)}, où un antagonisme est observé in vivo pour des concentrations élevées des 2 composés, à savoir 2 % en digluconate de chlorhexidine et 2 % en laurylsulfate de sodium.

Bien que ces résultats ne portent que sur 3 souches bactériennes, ils confirment l'importance de l'optimisation d'une formulation antiseptique, en termes d'excipients associés au principe actif. Ainsi, l'interaction CHX/DOSSNa, considérée globalement comme antagoniste, se révèle ici compatible, voire bénéfique, lorsqu'une concentration en DOSSNa de 0,10 % est associée à 0,10 % de digluconate de chlorhexidine. Une perte partielle de l'activité biologique peut être observée pour des concentrations en DOSSNa supérieures (1 %). Ces résultats corroborent l'étude de ^{Luc et al. (1998)} démontrant une potentialisation de l'activité bactéricide intrinsèque de la chlorhexidine au sein du bain de bouche de référence. En effet, les essais présentés dans cette étude indiquent également une activité supérieure, en termes de réduction logarithmique, du bain de bouche par rapport à la solution aqueuse de digluconate de chlorhexidine seule à 0,10 %. Ce phénomène pourrait être lié, au moins en partie, à la présence d'un agent anionique, le DOSSNa, à faible concentration, dans la formulation.

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