Activité bactéricide de bains de bouche contenant 0,10%, 0,12% et 0,20% de digluconate de chlorhexidine

Introduction

La chlorhexidine sous forme de digluconate est actuellement la molécule antiseptique la plus utilisée dans les traitements bucco-dentaires, notamment sous forme de bains de bouche. Ses propriétés antimicrobiennes reconnues ^{(Baker et coll., 1987} ; ^{Stanley et coll., 1989} ; ^{Luc et coll., 1991)} permettent son indication dans le contrôle de plaque et l'hygiène gingivale ^{(Khoo et Newman, 1983} ; ^{Grossman et coll., 1986} ; ^{Segreto et coll., 1986} ; ^{De la Rossa et coll., 1988} ; ^{Banting et coll., 1989)}. En France, les bains de bouche à 0,10 et 0,20 % sont commercialisés depuis de nombreuses années. Plus récemment, sont apparues sur le marché des préparations à 0,12 %. L'efficacité de ces différentes formulations est actuellement controversée ^{(Addy et Wade, 1995} ; ^{Harper et coll., 1995)}. Si un effet dose existe pour une gamme étroite de solutions aqueuses de chlorhexidine (comprises en 0,10 et 0,20 %) (^{Candro et coll., 1973} ; ^{Cumming et Löe, 1973} ; ^{Jenkins et coll., 1989)}, son existence dans des produits formulés est moins certaine du fait des problèmes de compatibilité entre excipients et chlorhexidine ^{(Barkvoll et coll., 1989)}.

Différents travaux ^{(Addy, 1986} ; ^{Addy et Wade, 1995)} font état d'une évaluation in vitro de l'activité antimicrobienne des préparations antiseptiques, par détermination des concentrations minimales (ou des dilutions maximales) inhibitrices de croissance. Cependant, ces méthodes classiquement utilisées pour l'évaluation de l'activité des antibiotiques paraissent inadaptées à l'étude des antiseptiques ^{(Nicoletti et coll., 1993} ; ^{Walker et Lowes, 1985)} et donnent peu d'indication sur l'efficacité réelle des bains de bouche en raison du long temps de contact in vitro avec les micro-organismes test, et des interférences du produit avec le milieu de culture. La détermination de l'activité bactéricide nécessite un court temps de contact et un milieu réactionnel neutre afin d'éviter toute interaction avec le(s) principe(s) actif(s). Pour évaluer l'efficacité d'un antiseptique, l'AFNOR et la Pharmacopée française préconisent la détermination d'une activité bactéricide dans des conditions d'essai représentatives des conditions d'utilisation, notamment la température et à la durée réelle d'application (^{Pharmacopée française, 1997} ; Recueil AFNOR " Antiseptiques et désinfectants ", 1986).

Lors de cette étude, les activités des bains de bouche à base de digluconate de chlorhexidine commercialisés en France, ainsi que des solutions aqueuses de digluconate de chlorhexidine aux concentrations correspondantes ont été évaluées selon la méthode préconisée par la Pharmacopée française ^{(Pharmacopée française, 1997)} puis testées sur des bactéries parodontales potentiellement pathogènes selon une microméthode adaptée.

Matériel et méthode

Bains de bouche

Les compositions en principe actif des bains de bouche testés ainsi que les dilutions recommandées par les fabricants sont indiquées dans le ^{tableau I} . Ce tableau fait également mention des solutions aqueuses de digluconate de chlorhexidine utilisées. Lors des essais, les solutions et dilutions de bains de bouche sont réalisées dans l'eau distillée stérile.

Souches bactériennes

Les souches bactériennes utilisées sont, d'une part, celles préconisées par la Pharmacopée française ^{(Pharmacopée française, 1997)} : Escherichia coli (Ec) CIP 54127, Pseudomonas aeruginosa (Pa) CIP A22, Staphylococcus aureus (Sa) CIP 53154, Enterococcus hirae (Eh) IP 5855, et d'autre part des souches de référence (collection Institut Pasteur, Paris) correspondant aux principales espèces impliquées dans les parodontites, pour les tests en microméthode : souches microaérophiles : Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) IP 52106T, Eikenella corrodens (Eic) IP 7075T, Capnocytophaga ochracea (Ca) IP 82101. Souches anaérobies : Prevotella intermedia (Pi) CIP 103607T, Porphyromonas gingivalis (Pg) IP 103680T, Fusobacterium nucleatum (Fn) IP 101130T, Campylobacter rectus (Cr) IP 10160, Peptostreptococcus anaerobius (Pa) IP 10102T, Actinomyces viscosus (Av) CIP 103147T. L'entretien et la préparation des suspensions d'essai des souches aérobies et aéro-anaérobies ont été réalisés selon les indications de la Pharmacopée française. Pour les souches anaérobies et microaérophiles, l'entretien et les dénombrements ont été effectués sur gélose au sang de mouton (Biomérieux), avec des incubations de 48 à 72 heures à 37 °C en incubateur anaérobie (N₂ : 80 %, H₂ : 10 %, CO₂ : 10 %) ou sous atmosphère contenant 5 % de CO₂ (Generbag, Biomérieux). Les suspensions bactériennes utilisées pour les essais ont été préparées extemporanément dans l'eau distillée stérile.

Méthodes

Dans un premier temps et afin de positionner les préparations antiseptiques par rapport à la réglementation française, les essais ont été réalisés selon la méthode par " dilution-neutralisation " décrite par la Pharmacopée française ^{(Pharmacopée française, 1997)}, dans les conditions d'utilisation [dilution préconisée par le fabricant ^{tableau I} et temps de contact de 1 minute proche du temps d'utilisation clinique] et vis-à-vis des quatre souches bactériennes préconisées (Ec, Pa, Sa et Eh). Dans un second temps, les activités bactéricides des mêmes solutions ont été comparées en testant leur activité antiseptique en fonction du facteur de dilution, selon une microméthode adaptée de la méthode précédente, vis-à-vis de souches à potentiel pathogène (Aa, Eic, Co, Pi, Pg, Fn, Cr, Pa, Av), après un temps de contact de 5 minutes ^{(Luc et coll., 1991)}.

L'activité bactéricide des bains de bouche et des solutions de digluconate de chlorhexidine a été également déterminée sur souches pathogènes selon une microméthode par dilution-neutralisation ^{(Luc et coll., 1991)}. Des dilutions sériées de raison deux des solutions essais sont réalisées en eau distillée stérile (100 µl par puits) sur microplaques à 96 puits (Nunc). Dix microlitres de la suspension bactérienne (souches pathogènes microaérophiles et anaérobies) ajustée à 2.10⁹/ml sont ajoutés à chaque cupule. Après 5 minutes de contact, un transfert (50 µl) est réalisé vers une microplaque de neutralisant (6 % saponine, 6 % polysorbate 80) (150 µl par puits). Après 10 minutes, un transfert est réalisé sur gélose (12 cm x 12 cm), à l'aide d'un ensemenceur multipoint. Pour chaque souche, les témoins de croissance et de stérilité du milieu, ainsi que la validation de la neutralisation (innocuité du neutralisant, efficacité de la neutralisation de chaque solution essai) sont contrôlés. Les milieux de culture et les conditions d'incubation sont celles précédemment décrites. Les essais en microméthode sont doublés et les résultats sont exprimés en Dilution Maximale Bactéricide (la plus grande dilution provoquant une stérilisation du milieu).

Résultats

Méthode Pharmacopée française

Les valeurs des réductions logarithmiques des bains de bouche et des solutions de chlorhexidine correspondantes, pour les quatre souches référencées, sont présentées dans le ^{tableau II} . Les résultats représentent la moyenne sur deux dénombrements et sont exprimés en logarithme décimal de réduction par rapport à la suspension initiale.

Selon la Pharmacopée française, une préparation est dite antiseptique si elle permet de réduire de 5 log les différentes populations de germes test dans les conditions d'utilisation recommandées. Lorsque la durée de contact est limitée à 1 minute, les solutions contrôles (solutions aqueuses de chlorhexidine) ne répondent pas à ces exigences, les taux de réduction étant trop faibles sur les bactéries Gram +. Les solutions contrôles à 0,10 et 0,12 % présentent des activités similaires.

De même, deux préparations sur cinq, la préparation B à 0,12 % et la préparation C à 0,12 % sans alcool, ne peuvent être considérées comme antiseptiques à la dilution d'utilisation. Formulée en présence d'alcool, la préparation C devient antiseptique du fait d'une activité améliorée sur S. aureus.

Les autres bains de bouche A, C et D, formulés respectivement à 0,20 %, 0,12 % et 0,10 % en chlorhexidine, présentent un spectre élargi aux bactéries Gram +, notamment à E. hirae, non sensible aux solutions aqueuses de chlorhexidine. De ce fait, ces dernières formulations deviennent antiseptiques et voient leur activité bactéricide globale accrue par rapport aux solutions contrôles de chlorhexidine. Ainsi, la préparation D à 0,10 % testée au 1/3 (0,033 % en chlorhexidine) présente un spectre antibactérien plus large que la solution aqueuse de chlorhexidine à 0,20 %.

Activité antiseptique sur les bactéries pathogènes

Les résultats obtenus sur les souches parodontales en microméthode ^{tableau III} montrent une progression cohérente des réductions en fonction de la concentration en chlorhexidine (solutions contrôles), avec cependant toujours une faible discrimination entre les solutions aqueuses à 0,10 % et 0,12 %.

Exceptée la préparation A à 0,20 %, les dilutions maximales actives des bains de bouche diffèrent de celles de leur solution aqueuse correspondante. C'est notamment le cas des préparations à 0,12 % en chlorhexidine dont les activités sur les bactéries parodontales sont généralement inférieures à celles de la solution aqueuse correspondante.

A l'opposé, la préparation D à 0,10 % montre une activité supérieure à toutes les solutions contrôles de chlorhexidine ainsi qu'aux préparations formulées à 0,12 %. Cette formulation atteint voire dépasse (sur Porphyromonas gingivalis et Fusobacterium nucleatum) l'activité de la solution aqueuse à 0,20 % en chlorhexidine, avec une dilution au 1/4 active sur l'ensemble des germes parodontaux, contre une dilution au 1/2 pour la chlorhexidine à 0,20 %.

Cette dernière méthode confirme la faible activité de la préparation B (0,12 %) comparativement aux solutions contrôles de chlorhexidine.

Discussion

Les résultats obtenus avec les solutions aqueuses de chlorhexidine sont proches de l'activité connue de la chlorhexidine ^{(Denton, 1991} ; ^{Bloomfield et Looney, 1992)}.

L'ensemble des résultats montre une activité hétérogène des bains de bouche à base de chlorhexidine, notamment sur les bacilles Gram négatif, dont est majoritairement composée la flore pathogène parodontale, l'efficacité étant soit accrue soit réduite par rapport à la chlorhexidine non formulée. Les différences d'activité et de spectre (bactéries Gram +) observées entre certains bains de bouche et les solutions aqueuses de chlorhexidine mettent en évidence l'importance de la formulation.

Les interactions chlorhexidine/autre principe actif ou chlorhexidine/excipients doivent être considérées avec précaution. Les formulations sont des mélanges complexes dans lesquels interviennent certainement différents types d'interactions aussi bien favorables que défavorables et l'activité résultante est difficile à estimer par rapport à l'activité de la molécule antiseptique seule.

Les excipients peuvent interagir avec la molécule antiseptique ^{(Beeuwkes et Rooij, 1986} ; ^{Larson et Laughon, 1987} ; ^{Nicoletti et coll., 1993)} et augmenter son efficacité en entrant en synergie avec elle et jouer un rôle de " booster " de l'activité bactéricide. Cette potentialisation peut être le résultat d'une combinaison chimique plus efficace ou d'un environnement physicochimique plus favorable, comme une stabilisation de la molécule active ou la conservation d'un pH proche du pH optimal d'activité.

Les excipients ou des principes actifs associés peuvent également posséder une activité bactéricide intrinsèque et élargir le spectre du principe actif. Ainsi, E. hirae, peu sensible à la chlorhexidine, devient sensible aux produits formulés (exceptée la préparation B). De même, les résultats obtenus avec les préparations C à 0,12 % semblent indiquer que la présence d'alcool dans la formulation lui confère une activité supplémentaire sur Staphylococcus aureus. On ne peut cependant conclure, en raison d'une éventuelle différence non décrite dans la composition de ces deux formulations.

De même, l'activité de la solution D à 0,10 % pourrait être liée à une association synergique entre la chlorhexidine et le chlorobutanol.

Au contraire, l'interaction peut être négative. L'activité globale de la molécule peut être partiellement ou totalement inhibée, comme nous l'avons observé pour la préparation B à 0,12 % sur les quatre germes test de la Pharmacopée, avec un spectre totalement incohérent par rapport à la solution aqueuse de chlorhexidine à 0,12 % et caractérisé par une perte d'activité sur les bactéries Gram négatif testées.

Bien entendu, la variation d'activité bactéricide du (des) principe(s) actif(s) associé(s) aux excipients ne présente pas les mêmes caractéristiques en fonction de la dilution, celle-ci pouvant entraîner une " réorganisation " de la formulation et modifier ainsi l'activité de la molécule active. Ainsi, les bains de bouche se sont généralement révélés moins actifs que leur solution contrôle de chlorhexidine vis-à-vis des bactéries parodontales, avec une perte d'efficacité plus " rapide " des préparations au cours de leur dilution.

En conclusion, les résultats obtenus indiquent que la concentration en chlorhexidine n'est pas un facteur prédictif de l'activité mais soulignent l'importance de la compatibilité de la chlorhexidine avec les différents principes actifs et excipients entrant dans la composition des bains de bouche. Ces composants peuvent aller dans le sens d'une inhibition de l'activité antibactérienne de la chlorhexidine (activité supérieure de la solution aqueuse de chlorhexidine à 0,12 % par rapport à une solution commercialisée à 0,12 %) ou au contraire d'une potentialisation (activité de la préparation à 0,10 % similaire à celle de la solution aqueuse de chlorhexidine à 0,20 %).

BIBLIOGRAPHIE

• ADDY M, WADE W. An approach to efficacy screening of mouthrinses : studies on a group of French products. (I) Staining and antimicrobial properties in vitro. J Clin Periodontol 1995;22:718-722.
• ADDY M. Chlorhexidine compared with other locally delivered antimicrobials. A short review. J Clin Periodontol 1986;13:957-964.
• BAKER PJ, COBURN RA, GENCO RJ, EVANS RT. Structural determinants of activity of chlorhexidine and alkyl bisbiguanides against the human oral flora. J Dent Res 1987;66:1099-1106.
• BANTING B, BOSMAN M, BOLLMER B. Clinical effectiveness of a 0,12 % mouthrinse over two years. J Dent Res 1989;68:1716-1718.
• BARKVOLL P, ROLLA G, SVENDEN A. Interaction between chlorhexidine digluconate and sodium lauryl sulphate in vivo. J Clin Periodontol 1989;16:593-598.
• BEEUWKES H, ROOIJ SH. Microbiological tests on operating theatre staff of a new disinfectant foam based on 1 % chlorhexidine gluconate. J Hosp Infect 1986;8:200-202.
• BLOOMFIELD SS, LOONEY E. Evaluation of the repetability and reproducibility of European Suspension Test methods for antimicrobial activity of disinfectants and antiseptics. J Appl Bacteriol 1992;73:87-93.
• CANCRO LP, KLEIN K, PICOZZI A. Dose response of chlorhexidine gluconate in a model in vivo plaque system. J Dent Res 1973;52:223-22.
• CUMMING BR, LÖE H. Optimal dosage and method of delivering chlorhexidine solution for inhibition of dental plaque. J Periodont Res 1973;8:57-62.
• DE LA ROSSA M, STURZENBERGER OP, MOORE DJ. The use of chlorhexidine in the management of gingivitis in children. J Periodontol 1988;59:387-389.
• DENTON GW. Chlorhexidine. In : Disinfection, sterilization and preservation. Block SS, eds. Philadelphia : Lea and Febiger, 1991 : 274-289.
• GROSSMAN E, REITER G, STURZENBERGER OP, DE LA ROSA M, DICKENSON TD, FERRETTI GA, LINDHAM GE, MECKEL AH. Six month study of the effects of a chlorhexidine monthrinse on gingivitis in adults. J Periodont Res 1986;21(S16):33-43.
• HARPER PR, MILSOM S, WADE W, ADDY M, MORAN J, NEWCOMBE RG. An approach to efficacy screening of mouthrinses : studies on a group of French products. (II) Inhibition of salive bacteria and plaque in vivo. J Clin Periodontol 1995;22:723-727.
• JENKINS S, ADDY M, NEWCOMBE R. Comparison of two commercially available chlorhexidine mouthrinses. II. Effects on plaque formation gingivitis and tooth staining. Clin Prev Dent 1989;6:12-16.
• KHOO JG, NEWMAN HN. Subgingival plaque control by a simplified oral hygiene regime plus local chlorhexidine or metronidazole. J Periodontol Res 1983;18:607-619.
• LARSON EL, LAUGHON BE. Comparison of four antiseptic products containing chlorhexidine gluconate. Antimicrob Ag Chemother 1987;31:1572-1574.
• LUC J, ROQUES C, FRAYRET MN, MICHEL G, DUCANI M, VANDERMANDER J. Activité bactéricide in vitro de 5 antiseptiques buccaux vis-à-vis des principaux germes impliqués dans les affections bucco-dentaires. J Parodontol 1991;10:381-387.
• NICOLETTI G, BOGHOSSIAN V, GUREVITCH F, BORLAND R, MORGENROTH P. The antimicrobial activity in vitro of chlorhexidine, a mixture of isothiazolinones (" Kathon " CG) and cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB). J Hosp Infect 1993;23:87-111.
• Pharmacopée française. 10^e édition. Préparations antiseptiques. 1997.
• Recueil AFNOR, " Antiseptiques et Désinfectants ". 1989.
• SEGRETO VA, COLLINS EM, BEISWANGER BB, DE LA ROSA M, ISAACS RL, LANG NP, MALLET ME, MECKEL AH. A comparison of mouthwashes containing two concentrations of chlorhexidine. J Periodont Res 1986;21(S16):23-32.
• STANLEY A, WILSON M, NEWMAN HN. The in vitro effects of chlorhexidine on subgingival plaque bacteria. J Clin Periodontol 1989;16:259-264.
• WALKER EM, LOWES JA. An investigation into in vitro methods for the detection of chlorhexidine resistance. J Hosp Infect 1985;6:389-397.