Une nouvelle famille de promoteurs de cicatrisation: les rtga, des analogues fonctionnels des héparanes sulfates

Le rôle des facteurs de croissance dans les phénomènes de réparation tissulaire constitue depuis une dizaine d'années un axe de recherche privilégié, y compris en parodontologie. Ces molécules polypeptidiques exercent des effets régulateurs essentiels sur les événements cellulaires de la cicatrisation : migration, prolifération, différenciation et production de protéines matricielles, via l'interaction avec des récepteurs de surface spécifiques exprimés par les cellules cibles.

Les destructions tissulaires de certaines lésions parodontales de grande taille n'étant pas réparables par une approche thérapeutique conventionnelle, l'utilisation de facteurs de croissance pourrait alors amplifier une réponse insuffisante pour promouvoir une cicatrisation qui inclurait la re-formation du système d'attache parodontal.

Certains facteurs de croissance ont été identifiés dans les tissus parodontaux, ce sont le Platelet-derived Growth Factor (PDGF), les Fibroblast Growth Factors (FGF), les Insulin-like Growth Factors (IGF), le Transforming Growth Factor-beta (TGF-ß), et certaines Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). Certains de ces facteurs de croissance possèdent la capacité de stimuler in vitro et in vivo les cellules ostéogènes, ou celles du ligament parodontal ^{(Terranova et coll., 1987} ; ^{Terranova et coll., 1991} ; ^{Matsuda et coll., 1992} ; ^{Oates et coll., 1995} ; ^{Graves et Cochran, 1994)}. L'association PDGF/IGF-I ayant montré des effets d'accélération de la cicatrisation de plaies cutanées (^{Lynch et coll., 1987}, ¹⁹⁸⁹), elle a été testée chez le chien dans le traitement de lésions parodontales spontanées. Rapidement, dès 2 semaines, il se produit une formation d'os, de cément et d'une nouvelle attache ^{(Lynch et coll., 1989} ; ^{Lynch et coll., 1991)}. Chez l'homme, cette combinaison de facteurs de croissance a induit un comblement significatif de lésions interradiculaires, moindre dans des lésions intra-osseuses proximales ^{(Howell et coll., 1997)}.

Des résultats intéressants ont également été obtenus avec les BMP sur des lésions parodontales expérimentales ^{(Ripamonti, 1996} ; ^{Ripamonti et Reddi, 1994} ; ^{Ripamonti et coll., 1994} ; ^{Sigurdsson et coll., 1995} ; ^{Jovanovic et coll., 1996} ; ^{Kinoshita et coll., 1997)}. L'association de BMP et d'allogreffes osseuses déminéralisées s'est révélée efficace dans le traitement de lésions intra-osseuses chez l'homme ^{(Bowers et coll., 1991)}. Les BMP-2 et 3 ont également montré un remarquable pouvoir de reconstruction osseuse dans des cas d'ostéotomies fémorales ^{(Yasko et coll., 1992)}, mandibulaires ^{(Toriumi et coll., 1991)} et crâniennes ^{(Ripamonti et coll., 1993)}. Cependant les BMPs ne peuvent pas être utilisées seules, et nécessitent la présence d'un support. Différents vecteurs ont été expérimentés : collagène (^{Cook et coll., 1994}, ¹⁹⁹⁵), hydroxyapatite ^{(Horisaka et coll., 1991} ; ^{Kuboki et coll., 1992)}, matrice osseuse ^{(Bowers et coll., 1991)}, corail ^{(Ripamonti et coll., 1993} ; ^{Ouhayoun et coll., 1994)} ou polymère d'acide polylactique et polyglycolique ^{(Miyamoto et coll., 1992} ; ^{Heckman et coll., 1991} ; ^{Isobe et coll., 1996)}.

Cependant, l'utilisation des facteurs de croissance en clinique humaine semble poser des problèmes sérieux. Pourtant certains d'entre eux, comme les BMPs, sont en phase d'expérimentation humaine. Le problème majeur concerne les doses de principe actif à utiliser. Des résultats contradictoires ont été obtenus pour des doses données, certains individus réagissant fortement et d'autres peu ou pas. Par ailleurs, une proportion élevée des principes actifs est rapidement spontanément détruite du fait des conditions défavorables qui prévalent dans les plaies. Des quantités considérables (par rapport aux quantités libérées naturellement dans les plaies) doivent être utilisées pour obtenir une réponse biologique cliniquement appréciable. Ces cytokines, intervenant toutes dans des réseaux de régulations physiologiques, seront certainement d'une manipulation complexe. En particulier, leur dangerosité, même si elle est beaucoup plus faible que proclamée au début de leur utilisation expérimentale, pourrait être un obstacle important : si ces molécules ne peuvent pas induire la formation de tumeurs, elles peuvent favoriser l'exacerbation d'une tumorisation spontanée en cours et cliniquement non décelée (ceci est un sujet de discussion dans le monde scientifique concerné). Il convient de préciser que ce risque théorique existe dès lors que des agents aussi puissants que les facteurs de croissance sont manipulés, quelle que soit la façon d'agir sur (ou avec) eux (y compris celui sur lequel nous travaillons). Enfin, le coût élevé de ces produits, synthétisés par génie génétique, devrait être un obstacle supplémentaire à une large diffusion.

Une autre stratégie est-elle concevable pour l'avenir ?

Certains des facteurs de croissance, les FGF-1 et 2, le TGF-ß, le PDGF et les BMPs, possèdent la propriété de se lier à des protéoglycanes de type héparane sulfate (HSPG), présents dans les matrices extracellulaires et à la surface des cellules ^{(Paralkar et coll., 1990} ; ^{Burgess et Maciag, 1989} ; ^{Mohan et Baylink, 1991} ; ^{McCaffrey et coll., 1992}, ¹⁹⁹⁴ ; ^{Ruppert et coll., 1996)}. Ils ont été regroupés pour cette raison sous la dénomination plus générique de facteurs de croissance se liant à l'héparine (HBGF). Cette liaison les protège de la dégradation protéolytique qui se produit lors de la détersion des plaies ^{(Paralkar et coll., 1990} ; ^{McCaffrey et coll., 1992}, ¹⁹⁹⁴ ; ^{Gospodarowicz et Cheng, 1986} ; ^{Saksela et coll., 1988)} et les rend disponibles pour stimuler les événements cellulaires et matriciels gouvernant la cicatrisation. A noter que si les IGF ne sont pas héparane sulfate dépendants, les protéines vectrices qui régulent leur biodisponibilité le sont ^{(Andress, 1995} ; ^{Booth et coll., 1996)}. De ce fait, ils peuvent être fonctionnellement, quoique indirectement, rattachés à la famille des HBGF.

Le besoin de hâter les phénomènes de cicatrisation, ou de les mettre en œuvre de façon efficace dans des situations cliniques difficiles, a conduit à rechercher des substituts fonctionnels aux HSPG. Une famille de biopolymères, dits RGTA (pour ReGeneraTing Agents), a été récemment développée à partir du dextrane par polysubstitution de groupes carboxyméthyles, benzylamides et sulfonates sur les unités glucose. Comme les HSPG, ces substituts fonctionnels protègent les FGF-1 et 2 et le TGF-ß de la dégradation protéolytique (^{Tardieu et coll., 1989}, ¹⁹⁹²) ; ^{Meddahi et coll., 1995}, ^1996a, ^1996b. De plus, les RGTA potentialisent in vitro les activités biologiques des FGF sur différents types cellulaires ^{(Tardieu et coll., 1992)}. In vivo, les RGTA se sont avérés de puissants promoteurs de cicatrisation sur différents tissus : peau ^{(Meddahi et coll., 1994)}, cornée ^{(Fredj-Reygrobellet et coll., 1994)}, muscle et nerfs ^{(Gautron et coll., 1995} ; ^{Aamiri et coll., 1995)}, côlon ^{(Meddahi et coll., 1996a} Comme dans tous les tissus, la cicatrisation osseuse fait intervenir des HBGF ^{(Andrew et coll., 1993} ; ^{Bourque et coll., 1993} ; ^{Sandberg et coll., 1993} ; ^{Bostrom et coll., 1995)}, qui ont été utilisés pour promouvoir la formation d'os dans des lésions expérimentales ^{(Takagi et Urist, 1982} ; ^{Joyce et coll., 1990} ; ^{Beck et coll., 1991} ; ^{Toriumi et coll., 1991} ; ^{Kawaguchi et coll., 1994} ; ^{Ripamonti et coll., 1996} ; ^{Vikjaer et coll., 1997)}. Nous avons étudié les effets des RGTA sur le milieu osseux en utilisant un modèle de craniotomie chez le rat, consistant à réaliser une lésion circulaire au niveau pariétal, de taille moyenne, afin d'évaluer à court et moyen termes le potentiel de cicatrisation des RGTA en site osseux. Cette évaluation s'est faite sur des radiographies et a été caractérisée histologiquement et par des méthodes histoenzymatiques et immunohistochimiques.

Données radiographiques sur la cicatrisation osseuse induite par les RGTA (fig. 1a, 1b et 2a, 2b)

Sur des plaies crâniennes standardisées médianes de 5 mm de diamètre chez le rat, la cicatrisation osseuse induite par les RGTA se fait de façon dose-dépendante, les concentrations efficaces se situant entre 25 et 100 µg/ml ^{(Blanquaert et coll., 1995)}. A ces concentrations, les scores moyens de cicatrisation osseuse à 35 jours étaient respectivement de 69 % et 77 %, supérieurs à ceux de défauts traités par matrice osseuse déminéralisée (54,7 %), et encore plus à ceux des lésions non traitées (33 %), démontrant le potentiel ostéogénique élevé des RGTA.

Alors que chez les témoins non traités, l'os s'était formé au contact des berges en assez faible quantité, les sites traités au RGTA présentaient une formation osseuse sur les berges, mais aussi au centre de la lésion sous forme de nodules isolés. Fait marquant, dans les lésions présentant le plus fort taux de comblement, une suture, le plus souvent en continuité avec la suture interpariétale, s'était différenciée.

Nous avons cherché à caractériser certains paramètres conférant à ces molécules un pouvoir de cicatrisation élevé ^{(Lafont et coll., 1994)}. Ainsi :

- le poids moléculaire du dextrane natif sur lequel les substitutions se font doit être élevé (Mr 40.10³) ;

- le pourcentage de groupes sulfates doit être important. Par ailleurs, la lésion du sinus sagittal médian annihilait l'effet du RGTA [comblement de 15 %, semblable à celui des défauts non traités (17,7 %), à opposer aux 63 % des défauts traités sans lésion du sinus], démontrant le rôle majeur de la vascularisation dans l'initiation du processus cicatriciel.

Caractères distinctifs des plaies traitées par RGTA (Lafont et coll., 1994 ; Colombier, 1995 ; Colombier et coll., 1998 ; Blanquaert et coll., 1995)

Sur des lésions latérales à la suture médiane, donc ne bénéficiant pas directement de l'apport vasculaire du sinus sagittal médian, un RGTA utilisé à faible dose (4 µg/ml) a induit une formation osseuse dès 7 jours, sous la forme de lames centripètes issues d'un épaississement osseux situé sur la face endocrânienne des berges de la plaie (^{fig. 3}, ^3b, ^3c et ^3d). Cette formation tendait à recouvrir les berges osseuses. Cette phase avait été précédée par une vague précoce de résorption, assurant l'élimination d'une zone d'os qui s'était nécrosée au cours de l'acte chirurgical. Les plaies non traitées étaient à ce stade très peu réactives.

Dans des lésions médianes traitées par RGTA, les lames osseuses centripètes étaient plus étendues et plus épaisses que chez les témoins. Comme constaté sur les radiographies, de l'os s'était déposé au centre des lésions sous forme de nodules (^{fig. 4}). Ceux-ci se différenciaient dans l'épaisseur du hamac fibreux joignant les berges de la plaie, de part et d'autre du sinus sagittal médian. Toutes ces néoformations osseuses avaient encore, 30 jours après l'acte chirurgical, un potentiel ostéoformateur important dont témoignait une épaisse couche ostéogénique (ostéoblastes + cellules ostéoprogénitrices), mise en évidence par marquage de la phosphatase alcaline (ALP) (^{fig. 5}). Au contraire, chez les témoins, cette couche était fine. L'os nouveau était plus mature dans les défauts traités par RGTA que chez les témoins : il était plus minéralisé et contenait moins d'espaces vasculaires (^{fig. 3}, ^3b, ^3c et ^3d).

Le hamac fibreux se différenciait plus précocement dans les lésions traitées par RGTA, il était aussi plus épais. Il contenait alors de grandes quantités de cellules ostéoprogénitrices (^{fig. 4} et ⁵). Chez les témoins, ces cellules, en relativement faible nombre, étaient localisées uniquement le long de la dure-mère et autour du sinus sagittal médian. Ces différences topographiques suggèrent que ces cellules migrent à partir de la dure-mère vers le hamac fibreux. La quantité élevée de cellules ostéoprogénitrices dans les plaies traitées au RGTA a une importance capitale sur le taux de comblement futur des lésions, car le nombre d'ostéoblastes actifs est proportionnel à celui des cellules ostéoprogénitrices recrutées ^{(Bruder et coll., 1994)}. Ces auteurs ont de ce fait postulé que le seul moyen d'augmenter la quantité d'os formé était d'orienter un maximum de cellules dans la voie ostéogénique, une propriété que possèdent à l'évidence les RGTA.

Le hamac accueille également des mastocytes après la deuxième semaine de cicatrisation. Ils apparaissaient plus précocement et en plus grand nombre dans les lésions traitées au RGTA. Les nombreux agents libérés par ces cellules, dont l'héparine et des facteurs de croissance, pourraient contribuer à la maturation des plaies ^{(Pennington et coll., 1992} ; ^{Sörbo et Norrby, 1992} ; ^{Hu et coll., 1994} ; ^{Qu et coll., 1995} ; ^{Reed et coll., 1995} ; ^{Norrby, 1997)}. Des lésions traitées ont complètement cicatrisé ^{(Lafont et coll., 1994}, ^{Blanquaert et coll., 1995}). L'anatomie concavo-convexe originale de la voûte crânienne s'est alors reconstituée, sans formation osseuse excessive. Ce respect anatomique incluait la re-formation d'une suture médiane de taille et de morphologie semblables à celles d'une suture normale ^{(Lafont et coll., 1998)}.

La vascularisation des plaies différait fortement après traitement au RGTA ^{(Colombier, 1995)}, particulièrement dans les zones latérales au sinus sagittal médian, où se développaient les nodules. Rapidement après la blessure, la densité vasculaire était plus importante chez les traités au RGTA, due à la fois à un accroissement du nombre de vaisseaux et à une augmentation de leur calibre, suggérant que les échanges métaboliques y étaient plus importants aux stades critiques précoces de la cicatrisation (^{fig. 6}).

Dans les lésions traitées au RGTA, le hamac résiduel contenait à 30 jours des quantités plus importantes de collagènes I et III et de fibronectine que chez les témoins ^{(Lafont et coll., 1998)} (^{fig. 7} et ^8a, ^8b . Ceci est à considérer, car collagène III et fibronectine ont un rôle majeur dans l'organisation tridimensionnelle d'un réseau extracellulaire régulant l'arrangement spatial des cellules, de la vascularisation et des composants matriciels impliqués dans la formation osseuse ^{(Lane et coll., 1986} ; ^{Page et coll., 1986)}.

Les ostéoblastes des plaies traitées par RGTA synthétisaient du collagène III, et des préostéoblastes synthétisaient de l'ostéocalcine ^{(Lafont et coll., 1998)}. Ces deux caractères sont propres aux cellules exprimant leur phénotype au cours du développement. Il ne s'agissait pas d'observations isolées car les défauts traités montraient d'autres caractères typiques du développement des os pariétaux, tels que :

- la formation des nodules ;

- la croissance de ces nodules à partir de la dure-mère ;

- la restauration de la suture médiane.

Aux phases initiales de la cicatrisation, les phénomènes inflammatoires différaient également fortement. Dans les lésions traitées au RGTA, l'infiltration aiguë par les polynucléaires était plus intense et régressait plus précocement. L'infiltration macrophagique était également différente ^{(Lafont, 1997)}. L'intensité et la durée des phénomènes inflammatoires sont considérées comme des paramètres importants pour le devenir des plaies, car elles détermineraient la quantité d'os formé dans des plaies osseuses ^{(Sandberg et coll., 1993)}.

Ces faits suggèrent que les RGTA ont le pouvoir de protéger des signaux émis normalement au cours du développement, et inhibés ou détruits dans les plaies d'animaux adultes. La protection de ces signaux permettrait l'expression de la programmation génétique locale, induisant la différenciation (ici la régénération) de structures anatomiques spécifiques. Cette notion est compatible avec l'opinion de ^{Frost (1989)} selon laquelle les anomalies de cicatrisation de l'os résultent de dysfonctionnements précoces des mécanismes de médiation (processus locaux multicellulaires incluant des réseaux propres de capillaires et de lymphatiques, différents types de cellules précurseurs, et un système local de communication), plutôt que de dérèglements cellulaires. Ces hypothèses sont congruentes avec les propriétés des RGTA, qui protégeraient les HBGF libérés localement de la dégradation protéolytique, leur permettant de déclencher les cascades métaboliques menant à un comblement d'os, régulé pour reproduire l'anatomie initiale des os lésés.

Effets des rgta dans d'autres modèles de cicatrisation osseuse

Dans un modèle de craniotomie partielle chez le lapin, ^{Albo et coll. (1996)} ont observé dans les lésions traitées une accélération de la cicatrisation et la reconstitution de l'anatomie externe et interne de l'os pariétal en 12 semaines alors que chez les témoins la structure de l'os restait immature.

Des ostéotomies fémorales de 5 mm chez des rat traités par RGTA et os déminéralisé ont manifesté une remarquable aptitude à la cicatrisation en 12 semaines. Il s'est en effet produit une fermeture du défaut et la reconstitution ad integrum de l'anatomie de l'os (re-formation du fût cortical et du canal médullaire). Les os traités sans RGTA montraient soit la persistance d'une solution de continuité entre les berges du défaut, soit une fermeture très partielle ne reconstituant pas l'anatomie de l'os ^{(Blanquaert, 1996)}.

Conclusion

Les RGTA s'avèrent être de puissants agents de cicatrisation osseuse. Il est intéressant de constater que chez le rat et le lapin, au niveau de sites osseux différents, ils n'induisent pas seulement la fermeture des défauts chirurgicaux, mais qu'ils assurent la restauration de l'anatomie originale des os lésés. Outre l'accélération des processus cicatriciels, les RGTA permettent la mobilisation d'un pool important de cellules compétentes à former de la matrice osseuse, et la mise en place rapide d'un réseau matriciel tridimensionnel propice à la migration des cellules recrutées. Une autre de leur propriété semble être de réactiver des phénomènes propres à la période du développement, qui ne sont plus opérants chez l'adulte.

Remerciements. Ces travaux ont été soutenus par la Fondation dentaire de France, l'Université René Descartes-Paris-V (Projet d'Excellence), par le ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche, et par le CNRS.

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