Etude in vitro de la sensibilité aux antibiotiques des bactéries anaérobies strictes associées à la maladie parodontale

Introduction

L'état actuel de la recherche établit clairement l'étiologie bactérienne des maladies parodontales ^{(Listgarten et Hellden, 1978} ; ^{Loesche et al., 1985} ; ^{Slots et Taubman, 1992)}. Certaines bactéries à Gram négatif anaérobies strictes jouent un rôle majeur dans la pathogenèse des parodontites chez l'homme. De même, certains germes à Gram positif semblent étroitement impliqués dans le processus de destruction du parodonte ^{(Socransky et Haffajee, 1992)}. Les principales espèces cultivables, retrouvées dans les sites qui présentent une destruction du parodonte, ont fait l'objet de nombreuses études ^{(Slots et al., 1985} ; ^{Socransky et Haffajee, 1991} ; ^{Socransky et Haffajee, 1992)}. Ces travaux impliquent des espèces telles que Fusobacterium spp, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia et Peptostreptococcus micros comme principaux agents anaérobies stricts impliqués dans les processus de destruction du parodonte. Plusieurs études longitudinales ^{(Pihlström et al., 1981} ; ^{Lindhe et Nyman, 1985} ; ^{Isidor et Karring, 1986} ; ^{Becker et al., 1990)} montrent que le traitement mécanique sous-gingival, associé à une éventuelle phase chirurgicale et une maîtrise de l'hygiène bucco-dentaire, est suffisant pour arrêter l'évolution d'une parodontite chronique de l'adulte. Tous les patients atteints de maladies parodontales ne répondent pas de façon identique aux thérapeutiques. Certains patients atteints de parodontites récurrentes présentent des pourcentages élevés de bactéries pathogènes (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum) dans les sites atteints par la maladie. Certains auteurs ont suggéré que ces patients nécessitaient une antibiothérapie associée aux traitements conventionnels ^{(Gusberti et al., 1988} ; ^{Christersson et al., 1989)}. En effet, le traitement antibiotique complète de façon indispensable les effets des traitements mécaniques et/ou chirurgicaux dans certaines formes de maladies parodontales ^{(Novak et al., 1988} ; ^{van Winkelhoff et al., 1989} ; ^{Loesche et al., 1991} ; ^{van Winkelhoff et al., 1992} ; ^{van Winkelhoff et al., 1996)}. Dans ces formes de maladies parodontales, l'antibiothérapie est nécessaire afin de maîtriser la flore pathogène sous- gingivale. Le choix d'une thérapeutique antibiotique est donc basé sur le diagnostic clinique mais, compte tenu des différences rencontrées dans la composition de la flore sous-gingivale, une étude microbiologique des sites atteints semble souhaitable, au moins dans certaines formes de la maladie. Certaines espèces bactériennes présentes dans des sites qui ont perdu de l'attache peuvent parfois nécessiter des concentrations d'antibiotique plus importantes que celles normalement décrites ^{(Gusberti et al., 1988)}. Pour cette raison, afin d'éliminer sûrement les pathogènes parodontaux présents, il convient d'apprécier leur sensibilité aux antimicrobiens. Dans certains pays où les antibiotiques sont utilisés de façon fréquente et massive, une surveillance accrue semble indispensable, d'une part pour indiquer les profils de sensibilité des principales espèces pathogènes, d'autre part pour détecter l'augmentation des phénomènes de résistance.

Le but de cette étude est de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) in vitro de six antibiotiques : métronidazole (MZ), érythromycine (EM), tétracycline (TC), amoxicilline (AMX), amoxicilline + acide clavulanique (AMC) et clindamycine (CM), respectivement pour Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium spp et Peptostreptococcus micros, isolés et identifiés à partir de prélèvements bactériens de poches effectués chez des patients atteints de maladies parodontales. L'analyse des valeurs trouvées, comparées aux données de la littérature, est réalisée afin d'apprécier d'une part l'évolution de la sensibilité des espèces aux antimicrobiens testés, et d'autre part le comportement actuel de ces souches vis-à-vis des molécules testées. Bien que fournissant une aide thérapeutique importante, les données obtenues ne doivent pas faire perdre de vue que les résultats fournis par de telles études peuvent parfois ponctuellement différer des résultats observés in vivo.

Matériel et méthode

Pour cette étude, 55 souches sauvages (14 Pi, 14 Pg, 14 Fspp et 12 Pm) ont été isolées chez 41 patients atteints de maladies parodontales. Pour ces 41 sujets, le diagnostic clinique posé était 15 parodontites à évolution rapide (PER), 13 parodontites juvéniles localisées (PJL) et 13 parodontites chroniques de l'adulte (PCA). Ces patients avaient été adressés pour un traitement de parodontologie au CHU de Toulouse (Rangueil), service du Pr Lodter, dans le cadre du Diplôme universitaire de Parodontologie et Occlusodontie du Dr Barthet. La plaque sous-gingivale a été prélevée au moyen de pointes de papier stériles sur chaque patient, au niveau des sites qui présentaient la symptomatologie clinique la plus avancée. Après prélèvement, la pointe de papier est introduite dans un milieu de transport spécifique des espèces anaérobies (VGMA III). Les prélèvements ont été ensemencés à l'intérieur d'une station de travail en anaérobiose (forma Scientific) au Laboratoire de Microbiologie buccale de la Faculté de Chirurgie dentaire de Toulouse, dans les 3 heures qui ont suivi, sur milieux gélosés non sélectifs (TCS ou gélose Columbia additionnés de sang de mouton, d'hémine et de ménadione) ainsi que sur milieu sélectif (TGY kanamycine vancomycine).

Les boîtes ont été étudiées au bout de 48 heures d'incubation à 37 °C et dans des périodes allant de 3 à 12 jours.

Identification bactérienne

L'identification des germes a été réalisée selon les critères usuels recommandés par le Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual ^{(Summanen et al., 1993)} et l'Institut Pasteur ^{(Sebald et Petit, 1997)} :

• morphologie des colonies et pigmentation ;

• aspect des germes à l'état frais ;

• coloration de Gram ;

• caractère anaérobie strict ;

• fluorescence en lumière ultra-violette (Bioblock Scientific, 4 W, 365 nm) ;

• tests biochimiques (fermentation des sucres, présence d'enzymes) et galerie d'identification spécifique comme le recommandent ^Summanen et ^{Sebald et Petit (1997)}.

Test de sensibilité aux antibiotiques

La sensibilité aux antibiotiques des souches isolées a été appréciée in vitro par la technique de l'epsilomètre Etest^® (AB Biodisk, Solna, Sweden). Il s'agit d'une méthode hybride entre la diffusion en milieu gélosé, reconnue non fiable pour les bactéries à pousse lente ^{(Balows et al., 1991} ; ^{Pavicic et al., 1992)} et la technique de référence des dilutions en milieu gélosé selon les normes M11A3 du National Comitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1995). Une bandelette Etest^® est déposée sur la gélose ensemencée par un inoculum de la souche à tester, et libère l'antibiotique qu'elle contient selon un gradient de concentration préétabli. Après incubation, une ellipse d'inhibition se forme autour de la bandelette (^{fig. 1}). A l'intersection de cette ellipse avec la bandelette, la concentration minimale inhibitrice de l'antibiotique peut être lue directement sur l'échelle des concentrations figurant sur la bandelette. Le Etest^® a pour avantage de donner, par lecture directe, une concentration minimale inhibitrice de l'antibiotique pour la souche testée, plutôt que d'apprécier l'efficacité de la molécule par la mesure d'une zone d'inhibition, technique reconnue comme mal adaptée aux bactéries à croissance lente et fastidieuse ^{(Ballows et al., 1991)}.

Six antibiotiques : métronidazole (MZ), érythromycine (EM), tétracycline (TC), amoxicilline (AMX), amoxicilline + acide clavulanique (AMC) et clindamycine (CM) ont été testés sur 60 souches bactériennes :

- 15 Peptostreptococcus micros : 12 souches sauvages et 3 souches de référence CIP 60.5, CIP 9634, CIP 33270.

- 15 Fusobacterium spp : 14 souches sauvages et une souche de référence CIP Fn 101130T ;

- 15 Prevotella intermedia : 14 souches sauvages et une souche de référence CIP 103607 (collection de l'Institut Pasteur) ;

- 15 Porphyromonas gingivalis : 14 souches sauvages et une souche de référence CIP 103683 ;

Résultats

Les valeurs des CMI₉₀ de chacun des antibiotiques pour chacune des souches sont regroupées dans les ^{tableaux I}, ^II, ^III et ^IV . Comparativement aux valeurs données dans la littérature ^{(Sutter et al., 1983} ; ^{Walker et al., 1985} ; ^{Abu fanas et al., 1991)}, un certain nombre de souches résistantes aux différents antibiotiques ont été trouvées.

Peptostreptococcus micros

33 % des souches sont résistantes à la tétracycline à une CMI de 8 µg/ml.

20 % des souches sont résistantes au métronidazole à une CMI > 32 µg/ml.

7 % des souches sont résistantes à l'érythromycine à une CMI de 4 µg/ml.

7 % des souches sont résistantes à l'amoxicilline à une CMI de 6 µg/ml.

Fusobacterium spp

80 % des souches sont résistantes à l'érythromycine à une CMI de 4 µg/ml.

20 % des souches sont résistantes à l'amoxicilline à une CMI de 1 µg/ml.

13 % des souches sont résistantes à la tétracycline à une CMI de 2 µg/ml.

13 % des souches sont résistantes à l'amoxicilline + acide clavulanique à une CMI de 0,063 µg/ml.

Prevotella intermedia

20 % des souches sont résistantes à l'amoxicilline à une CMI de 1 µg/ml.

13 % des souches sont résistantes au métronidazole à une CMI de 1 µg/ml.

Porphyromonas gingivalis

La totalité des antimicrobiens ont été efficaces sur les souches testées.

L'appréciation de la sensibilité aux six antimicrobiens testés sur les différentes souches isolées est reprise de façon synoptique dans le ^{tableau V} .

Discussion

Depuis les quinze dernières années, les bactéries anaérobies strictes associées aux parodontites sont très largement étudiées afin d'essayer d'identifier des espèces pathogènes en rapport avec des pertes d'attache ^{(Haffajee et al., 1984} ; ^{Dzink et al., 1988} ; ^{Magnusson et al., 1991)}. Ces études impliquent Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros et Fusobacterium spp dans les parodontites chroniques de l'adulte et les parodontites à évolution rapide, et Prevotella intermedia et Actinobacillus actinomycetemcomitans dans les formes juvéniles des parodontites. Un des buts du traitement consiste dans l'éradication totale ou partielle de ces pathogènes qui peut être réalisée par des thérapeutiques non chirurgicales (débridement parodontal). Dans les cas de non-réponse aux traitements et notamment dans les formes réfractaires de la maladie, l'adjonction d'une antibiothérapie ciblée sur les bactéries présentes est nécessaire. L'antibiotique retenu devra être reconnu actif sur la ou les souches identifiées, en se fondant sur les données de la littérature, sans négliger les tendances observées dans l'évolution des résistances de ces bactéries aux antimicrobiens.

Porphyromonas gingivalis

Toutes les souches de Porphyromonas gingivalis testées dans notre étude sont sensibles aux six antimicrobiens. Les valeurs de nos CMI sont en tous points concordantes avec celles avancées par d'autres auteurs ^{(Sutter et al., 1983} ; ^{Walker et al., 1985} ; ^{Abu Fanas et al., 1991} ; ^{Pajukanta et al., 1994)}.

Prevotella intermedia

En ce qui concerne les souches de Prevotella intermedia, il apparaît une évolution assez marquée de la sensibilité de cette espèce aux antibiotiques.

87 % des souches testées restent sensibles au métronidazole à une CMI de 1 µg/ml. Ce résultat est en accord avec d'autres études ^{(Sutter et al., 1983} ; ^{Abu Fanas et al., 1991} ; ^{Société Française de Microbiologie, 1993)}. La valeur de la CMI paraît constante dans le temps depuis les études antérieures ^{(Sutter et al., 1983} ; ^{Baker et al., 1983} ; ^{Walker et al., 1985} ; ^{Dubreuil, 1990)}. Le métronidazole semble être un antibiotique dont l'efficacité est raisonnablement prévisible sur cette espèce.

Pour ce qui est de l'amoxicilline, 20 % des souches testées sont résistantes à une CMI de 1 µg/ml. Si on compare cette valeur à celle d'études précédentes ^{(Abu Fanas et al., 1991} ; ^{Société Française de Microbiologie, 1993)}, il apparaît une élévation assez marquée. Cette remarque semble s'expliquer par le fait que cette espèce est de plus en plus résistante aux aminopénicillines par production d'une β-lactamase ^{(Sedallian et al., 1989)}. Selon ^Jacobs , la fréquence de production d'une β-lactamase serait en Europe de 42 % et de 65 % aux Etats-Unis, alors qu'elle était très faible il y a 12 ans ^{(Sedallian, 1986} ; ^{Sedallian et Roudon, 1988)}. Les souches productrices de β-lactamase sont en général sensibles à l'amoxicilline additionnée d'un inhibiteur de β-lactamase (acide clavulanique) (^{Jakobs et al., 1990}). Dans cette étude, toutes les souches résistantes sont effectivement sensibles à l'amoxicilline + acide clavulanique.

Fusobacterium spp

Des résultats identiques sont obtenus pour les souches de Fusobacterium : 20 % des souches sont résistantes à l'amoxicilline à une CMI de 1 µg/ml. Si l'on compare une à une les valeurs des CMI trouvées pour chaque souche par rapport à celles décrites par d'autres auteurs ^{(Dubreuil, 1990} ; ^{SFM, 1993)}, il est constaté une élévation assez marquée. Dubreuil, en 1990, considère que Fusobacterium nucleatum n'est plus constamment sensible à l'amoxicilline car de nombreuses souches produisent une pénicillinase (27 % en Europe et 41 % aux Etats-Unis). Fusobacterium mortiferum et Fusobacterium varium sont beaucoup plus résistants aux β-lactamines que Fusobacterium nucleatum et dans ce cas, il est nécessaire d'ajouter un inhibiteur de β-lactamase ou d'employer la céfoxitine ou l'imipénème.

Dans cette étude, une souche testée présente même une résistance à l'amoxicilline + acide clavulanique, ce qui laisse supposer une modification importante dans la sensibilité de cette espèce aux pénicillines. Si l'on se reporte aux résultats fournis en 1985 par ^Walker il ne semblait pas que cette espèce puisse être résistante à un tel principe actif. De plus, la bactérie semble non seulement capable de se protéger des β-lactamines (émission de β-lactamases) mais également de se prémunir contre les inhibiteurs de β-lactamases (acide clavulanique).

Par ailleurs, 80 % des souches sont résistantes à l'érytromycine à une CMI de 4 µg/ml. Ce résultat reste comparable en tous points aux résultats d'autres études ^{(Sutter et al., 1983} ; ^{Dubreuil, 1990)}. Certains auteurs font même état d'une résistance à 100 % aux macrolides ^{(Dubreuil, 1990)}. Par ailleurs, 87 % des souches de cette espèce sont sensibles à la tétracycline à une CMI de 2 µg/ml, résultats superposables à ceux d'autres études ^{(Sutter et al., 1983} ; ^{Société Française de Microbiologie, 1993)} et 100 % des souches testées sont sensibles au métronidazole à une CMI de 1 µg/ml. Ces résultats confirment l'efficacité de cet antibiotique. Il reste l'antimicrobien de choix pour cette espèce, comme le montrent les travaux réalisés par d'autres auteurs ^{(Dubreuil, 1990} ; ^{Pankuch et al., 1993)}.

Peptostreptococcus micros

80 % des souches testées sont sensibles au métronidazole à une CMI > 32 µg/ml. Cette valeur est plus élevée que celle avancée par d'autres auteurs ^{(Pankuch et al., 1993)} qui ont testé le genre Peptostreptococcus, sans distinction d'espèce. Ces résultats ne concernent que Peptostreptococcus micros. Ils confirment la sensibilité relative au métronidazole de cette espèce comme l'avançaient ^Walker et ^{Dubreuil (1990)}.

Les valeurs des CMI trouvées respectivement pour l'érythromycine et l'amoxicilline sont de 8 µg/ml et 6 µg/ml. Si l'on compare individuellement chaque valeur trouvée avec celles d'autres études ^{(Walker et al., 1985)}, il apparaît une élévation sensible des CMI de ces antimicrobiens pour Peptostreptococcus micros. Il semble (bien qu'étant sensible pour 93 % à ces molécules) que cette espèce se modifie. Quelques souches développent des phénomènes de résistance. Par ailleurs ces résultats confirment la sensibilité relative de cette espèce aux tétracyclines.

Face à l'évolution de la sensibilité des pathogènes parodontaux anaérobies stricts aux antibiotiques courants, il est indispensable d'établir leurs profils types de sensibilité. S'il y a non-réponse au traitement, plusieurs raisons pourront être évoquées parmi lesquelles l'inactivation d'un antibiotique par une des nombreuses souches en présence, mais aussi l'émergence d'une souche anaérobie présentant un mécanisme de résistance décrit ou non dans la littérature. Il devient nécessaire de mesurer la sensibilité aux antibiotiques des anérobies stricts pathogènes dans les maladies parodontales, afin d'apprécier l'activité des agents antibactériens et surtout de surveiller l'évolution des résistances aux antibiotiques de ces espèces. La raison vient de l'utilisation courante et massive des antibiotiques. Une telle surveillance devra être réalisée in vitro auprès de laboratoires de référence. Il ne faut cependant pas perdre de vue que les résultats fournis par de telles études peuvent parfois ne pas être corrélés par les résultats obtenus in vivo. Pour cette raison, des études cliniques doivent être menées en parallèle aux analyses de laboratoire, afin de confirmer les résultats obtenus.

Demande de tirés à part

P .-P. POULET, Faculté de Chirurgie dentaire, Laboratoire de Biologie bucco-faciale, 3, chemin des Maraîchers, 31063 Toulouse Cedex.

BIBLIOGRAPHIE

• ABU FANAS SH, DRUCKER DB, HULL PS, REEDER JC, GANGULI LA. Identification, and susceptibility to seven antimicrobial agents, of 61 Gram-negative anaerobic rods from periodontal pockets. J Dent 1991;19:46-50.
• BAKER PJ, SLOTS J, GENCO RJ, EVANS RT. Minimal inhibitory concentrations of various antimicrobial agents for human oral anaerobic bacteria. Antimicrob Agents Chem 1983;24:420-424.
• BALOWS A, HAUSLER Jr WJ, HERRMANN KL, ISENBERG HD, SHADOMY HJ. Manual of Clinical Microbiology. 5^th ed. Washington DC : American Society for Microbiology, 1991:1133-1137.
• BECKER BE, BECKER W, CAFFESSE RG, KERRY GJ, OCHSENBEIN C, MORRISON EC. Three modalities of periodontal therapy-5 year final results. II. J Dent Res 1990;69:219-224.
• CHRISTERSSON LA, VAN WINKELHOFF AJ, ZAMBON JJ, DE GRAAFF J, GENCO RJ. Systemic antibiotic combination therapy in recalcitrant and recurrent localized juvenile periodontitis. J Dent Res 1989;68:197 (abstr. 128).
• DUBREUIL L. Sensibilité des anaérobies stricts aux antibiotiques. Med Mal Infect 1990;20(hors série):101-106.
• DZINK JL, HAFFAJEE AD, SOCRANSKY SS. The predominant cultivable microbiota of active and inactive lesions of destructive periodontal diseases. J Clin Periodontol 1988;15:316-323.
• GUSBERTI FA, SYED SA, LANG NP. Combined antibiotic (metronidazole) and mechanical treatment effects on the subgingival bacterial flora of sites with recurrent periodontal disease. J Clin Periodontol 1988;15:353-359.
• HAFFAJEE AD, SOCRANSKY SS, EBERSOLE JL. Clinical, microbiological and immunological features associated with the treatment of active periodontosis lesions. J Clin Periodontol 1984;11:600-618.
• ISIDOR F, KARRING T. Long-term effect of surgical and non-surgical periodontal treatment. A 5-year clinical study. J Period Res 1986;21:462-472.
• JAKOBS MR, SPANGLER SK, APPELBAUM PC. Susceptibility of Bacteroides non-fragilis and Fusobacteria to amoxicillin, amoxicillin/clavulanate, cefoxitin, imipenem and metronidazole. Eur J Clin Microbiol Inf Dis 1990;9:417-421.
• LINDHE J, NYMAN S. Scaling and granulation tissue removal in periodontal therapy. J Clin Periodontol 1985;12:374-388.
• LISTGARTEN MA, HELLDEN L. Relative distribution of bacteria at clinically healthy and periodontally diseased sites in humans. J Clin Periodontol 1978;5:115-132.
• LOESCHE WJ, SYED SA, SCHMIDT E, MORRISON EC. Bacterial profiles of subgingival plaques in periodontitis. J Periodontol 1985;56:447-456.
• LOESCH WJ, SCHMIDT E, SMITH BA, MORRISON EC, CAFFESSE R, HUJOEL P. Metronidazole in periodontitis. II : effects upon treatment needs. J Periodontol 1991;62:247-257.
• MAGNUSSON I, MARKS RG, CLARK WB, WALKER CB, LOW SB, McARTHUR WP. Clinical, microbiological and immunological characteristcs of subjects with « refractory » periodontal disease. J Clin Periodontol 1991;18:291-299.
• National Committee for Clinical Laboratory Standards. Approved standard M11A3 methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria. Villanova : National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1995;15:n° 14.
• NOVAK MJ, POLSON AM, ADAIR SM. Tetracycline therapy in patients with early juvenile periodontitis. J Periodontol 1988;59:366-372.
• PAJUKANTA R, ASIKAINEN S, FORSBLOM B, PIEKKOLA M, JOUSIMIES-SOMER H. B lactamase production and in vitro antimicrobial susceptibility of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol Immunol 1994;6:123-125.
• PANKUCH GA, JACOBS MR, APPELBAUM PC. Susceptibilities of 428 Gram-Positive and Negative Anaerobic Bacteria to Bay Y3118 compared with their susceptibilities to Ciprofloxacin, Clindamycin, Metronidazole, Piperacillin-Tazobactam and Cefoxitin. Antimicrob Agents Chem 1993;37:1649-1654.
• PAVICIC MJAMP, VAN WINKELHOFF AJ, de GRAAFF J. In vitro susceptibility of Actinobacillus actinomycetemcomitans to a number of antimicrobial combinations. Antimicrob Agents Chem 1992;36:2634-2638.
• PIHLSTRÖM BL, ORTIZ-CAMPOS C, MCHUGH RB. A randomized four-year study of periodontal therapy. J Periodontol 1981;52:227-242.
• SEBALD M, PETIT JC. Méthodes de laboratoire. Bactéries anaérobies et leur identification, 2^e édition. Paris : Institut Pasteur, 1997:307 p.
• SEDALLIAN A. Sensibilité des anaérobies à huit antibiotiques. Path Biol 1986;34:645-647.
• SEDALLIAN A, ROUDON T. Activité in vitro de l'association amoxicilline-acide clavulanique sur les bactéries anaérobies. Path Biol 1988;36:678-681.
• SEDALLIAN A, BRU JP, DERRIENNIC M, DUBREUIL L. Anaérobies et bêta-lactamases. Med Mal Infect 1989;mai (hors série):107-111.
• SLOTS J, EMRICH LJ, GENCO RJ, ROSLING BG. Relationship between some subgingival bacteria and periodontal pocket depth and gain or loss of periodontal attachment after treatment of adult periodontitis. J Clin Periodontol 1985;12:540-552.
• SLOTS J, TAUBMAN MA. Contemporary Oral Microbiology and Immunology. St Louis : Mosby Yearbook, 1992:782 p.
• Société Française de Microbiologie. Communiqué du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie, 1993.
• SOCRANSKY SS, HAFFAJEE AD. Microbial mechanisms in the pathogenesis of destructive periodontal diseases : a critical assessment. J Periodont Res 1991;26:195-212.
• SOCRANSKY SS, HAFFAJEE AD. The bacterial etiology of destructive periodontal disease : current concepts. J Periodontol 1992;63:322-331.
• SUMMANEN P, BARON EJ, CITRON DM, STRONG CA, WEXLER HM, FINEGOLD SM. Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual. 5^th ed. Belmont : Star Publishing Company, 1993:230 p.
• SUTTER VL, JONES JM, GHONEIM ATM. Antimicrobial susceptibilities of bacteria associated with periodontal disease. Antimicrob Agents Chem 1983;23:483-486.
• VAN WINKELHOFF AJ, RODENBURG JP, GOENE RJ, ABBAS F, WINKEL EG, DE GRAAFF J.Metronidazole plus amoxycillin in the treatment of Actinobacillus actinomycetemcomitans associated periodontitis. J Clin Periodontol 1989;16:128-131.
• VAN WINKELHOFF AJ, TIJHOF CJ, DE GRAAF J. Microbiological and clinical results of metronidazole plus amoxycillin therapy in Actinobacillus actinomycetemcomitans associated periodontitis. J Periodontol 1992;63:52-57.
• VAN WINKELHOFF AJ, RAMS TE, SLOTS J. Systemic antibiotic therapy in periodontics. Periodontology 2000 1996;10:45-78.
• WALKER CB, PAPPAS JD, TYLER KZ, COHEN S, GORDON JM. Antibiotic susceptibilities of periodontal bacteria : in vitro susceptibilities to eight antimicrobial agents. J Periodontol 1985;56 (suppl):67-74.