Modifications de colonisation de la surface dentaire in vitro par streptococcus mutans induites par traitement préventif et/ou curatif avec un dentifrice à 1 % en siliglycol

Introduction

Si le rôle du brossage dans la prévention des caries n'est plus à démontrer, il n'est pas toujours suffisant ^{(Axelsson et al., 1994}). De ce fait, de nombreux travaux font état de l'effet « antiplaque » de principes actifs entrant dans la composition de dentifrices ou de solutions de prébrossage (^{Lang et Brecx, 1986} ; ^{Van der Ouderaa, 1991} ; ^{Fishman, 1992} ; ^{Netuschil et al., 1995} ; ^{Riep et al., 1999}). La mise en évidence de cette activité passe très souvent par l'évaluation in vitro de l'efficacité antimicrobienne de ces composés (^{Gjermo et Rolla, 1970} ; ^{Murata et al., 1990} ; ^{Dersot, 1995} ; ^{van der Weijden et al., 1998} ; ^{Pan et al., 1999}). Cependant, pour certaines molécules, les notices des dentifrices peuvent revendiquer un effet soit d'inhibiteur d'adhésion, soit de détachant de plaque, qui est relativement difficile à évaluer du fait notamment de la complexité de l'écosystème buccal (^{Bowden et al., 1975} ;¹⁹⁹⁷) et de la plaque supragingivale (^{Listgarten, 1994}). L'étude présentée ici concerne la mise en évidence in vitro de modifications de l'adhésion à l'émail dentaire de Streptococcus mutans induites par un dentifrice associant le fluorhydrate de nicométhanol, amine fluorée de deuxième génération, au siliglycol, un diméthicone copolyol présenté comme agent filmogène. Le choix de S. mutans en tant que bactérie test est fondé sur sa capacité d'adhésion aux surfaces dentaires, notamment en présence de sucrose ^{(Hamada et al., 1984}), faisant de cette bactérie un formateur de plaque et un déclencheur de carie reconnu (^{Hamada et Slade, 1980} ; ^{Emilson et Krasse, 1985} ; ^{Munshi et al., 1999} ; ^{Featherstone, 2000}). Afin d'évaluer le rôle des principes actifs présents (siliglycol et fluorhydrate de nicométhanol), des essais préliminaires ont été réalisés avec différents placebos versus la formulation verum. Une deuxième série d'expérimentations réalisées à l'aide d'un modèle artificiel de cavité buccale précédemment validé ^{(Zampatti et al., 1994a}) amène à une évaluation plus précise des effets observés : inhibition d'adhésion et/ou de colonisation, détachement de la plaque néoformée.

Matériel

Produits

La composition en principe(s) actif(s) des pâtes dentifrices testées est présentée dans le ^{tableau I} . Afin de définir le rôle antiplaque du siliglycol, une solution aqueuse à 1 % a également été testée lors des essais préliminaires.

Souche bactérienne

Tous les essais ont été réalisés sur S. mutans CIP 103220T, souche entretenue sur milieu Columbia enrichi par 5 % de sang de mouton stérile (Biomérieux, Craponne), incubé à 37 °C sous anaérobiose durant 24 heures.

Les suspensions bactériennes ont été réalisées extemporanément à chaque essai et ajustées à 10⁸ bactéries/ml en bouillon Schaedler (Biomérieux).

Les dénombrements de bactéries viables lors des différents essais ont été réalisés selon la technique des UFC (unités formant colonies), par inclusion en gélose Schaedler (Biomérieux), suivie d'une incubation de 4 jours à 37 °C.

Supports dentinaires

Les essais préliminaires ont porté sur des prémolaires humaines extraites dont la couronne a été sectionnée en 6 fragments. Les expérimentations en modèle bouche artificielle ont porté sur des prémolaires humaines extraites et sur des incisives temporaires humaines récupérées lors de leur élimination naturelle.

Dans tous les cas, les dents ou fragments de dents ont subi un premier nettoyage à l'hypochlorite de sodium à 5 % (+ ultrasons), suivi d'une seconde sonication (20 kHz ; Bioblock Scientific, Illkirch) en solution aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,9 %. Après rinçage abondant à l'eau distillée stérile, les dents ou fragments de dents ont été stérilisés à la chaleur humide (121 °C pendant 20 min).

Méthode

Essai préliminaire

Les 5 produits tests (^{tableau I}) ont été appliqués sur 5 fragments d'une même dent, le 6^e fragment servant de témoin (T = sans traitement). Les traitements ont consisté en des applications directes des produits, de 30 secondes et 5 minutes, à la surface de l'émail. Après chaque temps de contact, les échantillons, y compris l'échantillon témoin, ont été rincés à l'eau distillée stérile.

Les dents traitées (E) ou non (T) ont ensuite été mises en contact avec 10 ml de suspension de S. mutans ajustée à 10⁸ bactéries/ml de bouillon Schaedler.

Au bout de 18 heures de contact à 37 °C, les échantillons ont été récupérés et rincés à l'eau distillée stérile. Pour chaque temps de contact (30 s et 5 min), l'activité des produits a été évaluée par dénombrement des bactéries viables ayant adhéré à l'émail (récupération par raclage) au millimètre carré de surface dentaire et par observation au microscope électronique à balayage (MEB) (Cambridge Instruments ; Stereoscan 250 Mk3, Cambridge, Royaume-Uni) des échantillons ayant subi une fixation par une solution aqueuse à 2,5 % de glutaraldéhyde, une déshydratation et une métallisation à l'or. Chaque essai a été fait trois fois. L'analyse statistique a été réalisée par test de Wilcoxon apparié.

Modèle artificiel de cavité buccale

Le modèle utilisé a été précédemment décrit et validé par ^Zampatti et ^1994b). Il est constitué d'une chambre de verre thermostatée à 37 °C et maintenue sous une atmosphère de 95 % d'azote et 5 % de gaz carbonique (pression 20 mbar). Cette chambre inclut 4 supports ouverts à leur extrémité inférieure et qui sont alimentés en continu par un flux (0,125 ml/min) de salive artificielle (10,2 mmol/l NaCl, 10,7 mmol/l KCl, 0,29 mmol/l MgCl₂.6H₂O, 1,08 mmol/l CaCl₂.2H₂O, 2,20 mmol/l KH₂PO₄, 4,59 mmol/l K₂HPO₄, 2,38 mmol/l NaHCO₃, 0,25 g/l Bio-Trypcase [Biomérieux] et 0,25 g/l d'extrait de levure [Biomérieux], pH 7). La composante alimentaire est simulée par un apport de bouillon Schaedler durant 30 minutes, 3 fois par jour, et d'une solution de sucrose à 0,1 mol/l durant 30 minutes, 5 fois par jour (0,33 ml/min). L'ensemble du modèle est stérilisé à la chaleur humide avant chaque expérimentation et est maintenu sous hotte à flux laminaire durant la totalité de l'essai. Avant mise en place dans le modèle, une étape de préadhésion de S. mutans est réalisée par mise en contact des échantillons dentaires avec une suspension ajustée à 10⁸ bactéries/ml en bouillon Schaedler durant 4 heures à 37 °C. Les échantillons sont rincés à l'eau distillée stérile et placés dans les conditions décrites simulant l'écosystème buccal (angle de 25° par rapport à l'horizontale ; formation de plaque sur la zone vestibulaire).

Trois types de traitements ont été réalisés : application des produits avant l'étape de préadhésion, application des produits après 24 heures de simulation, application des produits avant l'étape de préadhésion et après 24 heures de simulation. Les essais ont porté sur le produit verum et le placebo comparés à des échantillons dentaires non traités. Après chaque phase, les échantillons, y compris l'échantillon témoin, ont été rincés à l'eau distillée stérile.

L'activité des produits a été évaluée de la même manière que lors des essais préliminaires : dénombrement des bactéries viables ayant adhéré au millimètre carré d'émail et observation au MEB. Les essais ont été réalisés deux fois chacun. Les dénombrements bactériens ont fait l'objet d'une analyse comparative par test de Wilcoxon.

Résultats

Essai préliminaire

L'effet des 5 traitements aux 2 temps de contact est exprimé en réduction logarithmique par rapport aux dénombrements de bactéries viables ayant adhéré aux dents non traitées (log T - log E). Ces valeurs (moyenne ± erreur standard) sont présentées sur la ^{figure 1} . Le placebo entraîne une réduction de 0,6 et 0,7 log pour respectivement les temps de contact de 30 secondes et 5 minutes. Les placebos en fluor et en siliglycol induisent des réductions de plaque de l'ordre de 1 log dans les 2 cas, mises en évidence lors des observations par MEB ( ^{fig. 2} : témoin ; ^{fig. 3} : essai placebo en fluor). La solution aqueuse à 1 % de siliglycol présente une activité « antiplaque » similaire à celle du placebo correspondant. Enfin, une réduction logarithmique significative (p ≤ 0,01) d'environ 2 log est observée avec le dentifrice verum. La ^{figure 4} traduit bien cette limitation de la colonisation de la surface de l'émail, caractérisée par la présence de rares microcolonies. Dans tous les cas, aucune différence significative n'a été notée entre les traitements 30 secondes et 5 minutes, démontrant un effet rapide et peu temps-dépendant.

Modèle artificiel de cavité buccale

Les réductions logarithmiques (moyenne ± erreur standard) observées pour les 3 types de traitements (avant contact avec les bactéries, après simulation de formation de plaque, avant/après) sont présentées sur la ^{figure 5} en ce qui concerne les incisives temporaires et sur la ^{figure 6} pour les prémolaires. Sur dents temporaires, le traitement final par le placebo n'entraîne pas de réduction significative du nombre de bactéries ayant adhéré (0,02 log). Ce produit induit une réduction de l'ordre de 1,25 log en prétraitement, qu'il soit ou non associé à un traitement final. Le traitement par la pâte dentifrice verum se caractérise par un effet du prétraitement (réduction de 2 log) et du traitement final (réduction de 2 log) conduisant à un effet cumulé très important (réduction de 3 log). Les ^{figures 7}, ⁸ et ⁹ (respectivement témoin, essai verum avant et essai verum avant/après) présentent bien la progression de l'effet antiplaque observé. Les réductions bactériennes sont alors significativement supérieures à celles notées avec le placebo quel que soit le type de traitement (^{fig. 5}). Une différence significative (p ≤ 0,05) est également notée entre le traitement par le produit verum avant/après et le prétraitement seul ou le traitement final seul par le produit verum. Sur dents permanentes, les effets observés sont relativement similaires. Nous notons cependant des effets moins marqués pour le dentifrice placebo. L'effet cumulé des 2 types de traitements par le dentifrice verum conduit également à une réduction significative de 3 log (p≤ 0,005 par rapport au placebo ; p ≤ 0,05 par rapport au verum utilisé en prétraitement ; p ≤ 0,005 par rapport au verum utilisé en traitement final).

Discussion

L'essai préliminaire tel qu'il est décrit correspond à la mise en évidence d'un effet inhibiteur d'adhésion et/ou de colonisation. En effet, les surfaces dentaires sont ici traitées par les produits tests et rincées avant la mise en contact avec S. mutans. Les effets observés correspondent donc à un conditionnement des surfaces qui peut non seulement limiter le phénomène d'adhésion initial mais aussi la croissance secondaire des bactéries ayant adhéré. Les résultats obtenus démontrent une efficacité similaire des placebos en fluor et en siliglycol. Cependant, nous devons noter que, parallèlement au phénomène de « bactériophobie » décrit par ^Shern pour ce type d'agent cationique, l'activité inhibitrice de croissance des composés fluorés est un phénomène connu (^{Schmid, 1981} ; ^{Salem et al., 1987} ; ^{Kay et Wilson, 1988}). Des travaux récents indiquent même des effets bactéricides rapides in vitro ^{(Pan et al., 1999}) en rapport avec l'activité antiplaque (^{Netuschil et al., 1995} ; ^{Riep et al., 1999}) et anticaries ^{(Featherstone, 2000)} observée in vivo. Dans le cas du siliglycol, une activité antimicrobienne, du moins aux concentrations utilisées, ne peut être revendiquée dans la réduction de plaque observée. Ce composé présente donc un mode d'action antiplaque original, fondé sur un effet inhibiteur d'adhésion bactérienne. Le phénomène observé concerne alors aussi bien la phase d'adhésion initiale que celle de colonisation secondaire, observées classiquement dans la formation des biofilms (^{Roques, 2000}). Parallèlement, les essais réalisés avec la solution aqueuse à 1 % de siliglycol sont caractérisés par un effet similaire à celui du placebo correspondant. Ce point est très important à souligner dans la mesure où il valide la formulation même du dentifrice, avec maintien de l'entière efficacité du produit. De la même manière, la comparaison de l'activité « antiplaque » des placebos en fluor et en siliglycol avec le dentifrice verum confirme l'optimisation de la forme galénique finale avec cumul de l'effet des 2 composés, amenant à une réduction de colonisation de l'émail significative. Les essais menés en modèle artificiel de cavité buccale permettent de mieux définir le rôle du siliglycol. En effet, ce modèle nous permet d'évaluer l'effet inhibiteur de la colonisation tel qu'il a été défini pour l'essai préliminaire, mais nous amène également à considérer l'effet de détachant sur la plaque formée. Ainsi, les résultats obtenus lors d'un traitement préalable au contact de S. mutans et mise en place dans le modèle de cavité buccale confirment les résultats de l'essai préliminaire avec des réductions logarithmiques comprises entre 1,5 à 2 log pour le dentifrice verum. Cet effet est aussi bien observé sur dents temporaires que permanentes. Ainsi, le siliglycol constitue un véritable agent filmogène qui, associé au fluorhydrate de nicométhanol, conditionne la surface dentaire. Récemment, ^Haïkel ont également démontré le rôle inhibiteur d'adsorption d'une protéine salivaire, in vitro, aussi bien du fluorhydrate de nicométhanol que du siliglycol, avec un effet synergique net entre les deux composés. L'effet observé par ces auteurs peut même apparaître très rapidement (en 5 minutes). Parallèlement, le traitement verum après simulation de formation de plaque se traduit aussi par une réduction significative du nombre de bactéries ayant adhéré. Ainsi, le produit testé présente bien une activité détachante sur la plaque formée. La résistance des biofilms aux agents antimicrobiens, par rapport aux bactéries planctoniques, est un phénomène largement reconnu (^{Roques, 2000}), y compris dans le domaine de l'hygiène bucco-dentaire ^{(Pan et al., 1999}). L'originalité de la formulation testée repose donc sur l'association détachement/activité antibactérienne, concept très actuel dans le domaine du traitement des biofilms (^{Eleazar et al., 1997} ; ^{Pineau et al., 1997}). La combinaison de l'effet inhibiteur de colonisation et du détachement amène à une réduction de plaque très importante. Ces résultats traduisent l'intérêt de la pâte dentifrice testée dans ses 2 rôles primordiaux, à savoir élimination de la plaque lors du brossage et prévention de la formation de nouvelle plaque, et ce aussi bien sur dents permanentes que sur dents temporaires, ce qui justifie l'utilisation d'un tel produit dans le contrôle de plaque chez l'adulte et chez l'enfant. Comme le souligne ^{Kornman (1986)}, si une élimination totale de la plaque dentaire ne peut être envisagée, un traitement préventif peut être réalisé en jouant sur l'aspect quantitatif et/ou qualitatif. Ainsi, ce type de formulation combinant relargage de fluor et conditionnement des surfaces dentaires par des polymères constitue, selon Haïkel (^{Haïkel et al., 1997} ; ^{Haïkel, 1998}), une des perspectives de prévention de la carie dentaire.

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