Évaluation de trois tests de détection bactérienne dans les parodontites avancées du jeune adulte

Introduction

Différents modèles d'infection parodontale ont été proposés. Les recherches récentes en parodontie ont montré l'association fréquente de bactéries à fort potentiel pathogène avec les maladies parodontales (^{Bragd et coll., 1987} ; ^{Wennstrom et coll., 1987} ; ^{Ashley et coll., 1989} ; ^{Socransky et coll., 1991}).

De nombreux travaux soutiennent le concept de l'infection spécifique. Pour ^{Slots et coll. (1990)} et ^{Savitt et coll. (1991)}, la fréquence de détection, la concentration et le fort potentiel pathogène de Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) et Prevotella intermedia (P. intermedia) suggèrent un rôle étiologique majeur de ces bactéries dans les parodontites juvéniles et les parodontites à progression rapide.

^{Dahlén (1993)} souligne les contraintes des cultures dans l'identification des micro-organismes parodontaux. Cette méthode nécessite un milieu de transport adapté, des conditions anaérobies longues et complexes (^{Zambon et coll., 1994}). Des espèces peuvent disparaître lors du transport (^{van Steenbergen et coll., 1993}) ou lors des étapes de culture (^{Zambon et coll., 1985}), ou n'être pas cultivables, comme les Spirochètes (^{Loesche et coll., 1992b}).

^{Strzempko et coll. (1987)}, et ^{Savitt et coll. (1988)} ont alors proposé des tests plus rapides et plus sensibles : les sondes ADN. Les tests exploratoires à l'acide désoxyribonucléique (sondes ADN) sont basés sur la structure en double hélice de ces molécules d'ADN qui sont formées de deux brins identiques et dont une partie de la séquence des bases est spécifique à chaque espèce vivante. Le seuil de détection obtenu est bas, d'environ 10³ bactéries, mais le choix et la longueur de la séquence influent sur la spécificité de la sonde, car des hybridations croisées peuvent se produire (^{Dahlén, 1993}).

Récemment un test immuno-enzymatique a été proposé aux cliniciens pour le diagnostic au fauteuil des trois bactéries A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis et P. intermedia (Evalusite^®). L'objectif de cette étude a été de comparer l'efficacité de détection des trois pathogènes cités par le test Evalusite^® aux deux méthodes de référence actuelles (cultures bactériennes et sondes ADN), chez des patients atteints de parodontites avancées du jeune adulte, sans tenir compte du diagnostic clinique.

Matériel et méthode

Patients

Douze patients atteints de parodontites du jeune adulte de 18 à 33 ans (moyenne d'âge 25 ans) du service de Parodontologie de la Faculté de Chirurgie Dentaire Paris VII, présentant des poches parodontales multiples et une inflammation gingivale marquée, ont été inclus dans cette étude.

Les patients retenus devaient être en bonne santé générale, volontaires pour participer à l'étude, présenter des sites saignant au sondage, sans avoir pris d'antibiotiques ou subi de traitement parodontal dans les trois derniers mois, et être positifs pour au moins une des espèces microbiennes A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, à une concentration de 104 bactéries.

Après prélèvement bactérien dans les deux poches les plus profondes (+ ou - 6 mm) de deux quadrants différents, avec évidence de lésions osseuses à la radiographie, les indices suivants ont été relevés :

- l'indice de plaque (IPl) de ^{Sillness et Löe (1964)} de la face de la dent analysée ;

- l'indice gingival de ^{Löe et Sillness (1963)} de la face de la dent analysée ;

- l'indice de saignement au sondage de ^{Mühleman et Son (1971)} ;

- l'indice radiographique de lyse osseuse (^{Schei et coll., 1959}).

Identification bactérienne

Deux prélèvements par patient ont été pratiqués en insérant trois pointes de papier stériles (Mynol medium) pendant 15 secondes au fond des poches parodontales tests. Ces prélèvements simultanés par plusieurs pointes de papier sont une méthode fiable permettant d'obtenir des échantillons bactériens comparables (^{Ryerson et coll., 1994}) :

- une pointe de papier a été placée dans un tube Eppendorff vide de 1,5 ml et adressée par simple courrier pour traitement par sondes ADN (Omnigene, Cambridge, Etats-Unis) ;

- une pointe de papier a été placée dans un milieu de transport pour cultures (VMGA III de Möller, modifié par ^{Slots et coll., 1986}) pour analyse par cultures bactériennes au Laboratoire de Microbiologie de G. Dahlén (Göteborg, Suède). Les prélèvements devaient être mis en culture sous 48 heures ;

- une pointe de papier a été analysée sur place à l'aide du Kit Evalusite^® (Eastman Kodak, Rochester, Etats-Unis).

Celui-ci comprend 10 cellules tests (deux puits réactionnels et un puits témoin dans chaque cellule) et cinq réactifs sont nécessaires. Les différentes étapes techniques se déroulent ainsi : la pointe de papier est placée dans un tube échantillon dans lequel une solution (A) d'enzymes protéolytiques avec stabilisant hydrolyse les liaisons peptidiques retenant les antigènes membranaires à la surface des bactéries. Le liquide est ensuite versé dans un des puits réactionnels de la cellule-test contenant les anticorps anti-A. actinomycetemcomitans, anti-P. gingivalis et anti-P. intermedia : une réaction antigène-anticorps (Ag-Ac) peut se produire si les antigènes de ces micro-organismes sont présents dans l'échantillon recueilli. Une solution (B) d'une enzyme (la peroxydase de raifort) conjuguée à des anticorps IgG de lapin anti-A. actinomycetemcomitans, anti-P. gingivalis et anti-P. intermedia est ensuite ajoutée et une réaction se produit entre ce conjugué et les antigènes déjà capturés. Une solution (C) de lavage tensio-active élimine les antigènes ou conjugués qui n'ont pas formé de complexes. Une solution incolore (D) vire au rose-rouge en présence de peroxydase, si les complexes sont présents. Enfin une solution d'acide benzohydroxamique (E) stoppe la coloration. Ces réactions se déroulent en 5 minutes (^{fig. 1}) et la lecture des cellules doit être effectuée dans les 15 minutes (^{fig. 2}).

Les deux laboratoires de traitement pour les sondes ADN et les cultures bactériennes sont fréquemment cités pour leurs travaux en recherche parodontale (^{Dahlén et coll., 1989}, 1992 ; ^{Savitt et coll., 1988}) et n'étaient pas informés des objectifs de cette étude.

Un seuil de 10⁴ bactéries a été choisi pour considérer le test positif.

Les résultats des cultures bactériennes ont été exprimés en nombre de bactéries cultivées après incubation en chambre anaérobie. Le seuil de détection varie selon les auteurs (^{Tay et coll., 1992} ; ^{Loesche et coll., 1992b} entre 10² et 2 ± 10⁵ bactéries. Les résultats des sondes ADN ont été exprimés de façon semi-quantitative par analyse densitométrique des « dots-blots ». Le seuil de détection des molécules d'ADN correspond selon Omnigene à 10³ bactéries et les résultats positifs sont établis entre 6 ± 10³ et 6 ± 10⁵ bactéries. Les résultats d'Evalusite^® ont été exprimés par lecture des colorations obtenues. Selon le fabricant, une coloration rose représenterait une concentration de 10⁶ à 10⁷ bactéries et une coloration rouge correspondrait à une concentration supérieure à 10⁷ bactéries. La coloration serait soumise aux variations de solubilité des antigènes membranaires et à la surproduction ou au relargage d'antigènes.

Résultats

Les 12 patients retenus pour l'expérimentation présentaient des sites dont les caractéristiques cliniques sont reportées dans le ^{tableau I} : les profondeurs de poche étaient élevées (moyenne 7,29 ± 1,87 mm), l'indice gingival marqué (moyenne 2,00 ± 0,71) et l'indice de plaque était supérieur à 3 chez 7 patients sur 12 (moyenne 1,75 ± 0,72).

Un seul des patients a été positif pour les trois bactéries. Le test Evalusite^® n'a jamais détecté de A. actinomycetemcomitans.

Au seuil de détection retenu de 104 bactéries, la fréquence de détection de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis et P. intermedia s'est révélée bien plus forte par la technique des sondes ADN que par celle des cultures bactériennes, ou que par celle du test Evalusite^® :

- pour A. actinomycetemcomitans : 41,6 % par les sondes ADN, 33,3 % par les cultures, 0 % par Evalusite^® ;

- pour P. gingivalis : 54,2 % par les sondes ADN, 29, 2 % par les cultures, 33,3 % par Evalusite^® ;

- pour P. intermedia : 45,8 % par les sondes ADN, 50 % par les cultures, 33,3 % par Evalusite^® (^{tableau II}).

En modifiant le seuil de détection et en le portant à 105 bactéries, les fréquences de détection obtenues par les sondes ADN et les cultures sont réduites fortement, alors que celles obtenues par le test Evalusite^® ne le sont pas (tableau non publié) :

- pour A. actinomycetemcomitans : 16,7 % par les sondes ADN et les cultures, 0 % par Evalusite^® ;

- pour P. gingivalis : 41,7 % par les sondes ADN, 29,2 % par les cultures, 33,3 % par Evalusite^® ;

- pour P. intermedia : 25 % par les sondes ADN, 29,2 % par les cultures, 33,3 % par Evalusite^®.

Le seuil de 10⁴ bactéries a seulement été retenu et les différents tableaux ne porteront que sur les résultats correspondant à ce seuil.

Les résultats donnés par les cultures et les sondes ADN sont assez homogènes : 6 sites sur 24 sont différents pour l'A. actinomycetemcomitans, 6 sites sur 24 sont différents pour P. gingivalis et 3 sites sur 24 sont différents pour P. intermedia, les autres sites concordant dans 79,2 % des cas (^{tableau III}).

Les sensibilités et les spécificités de détections des différentes bactéries ont pu être précisées statistiquement (^{tableaux IV} et ^V) :

- concernant A. actinomycetemcomitans : le test Evalusite^® présentait une sensibilité de 0 % et une spécificité de 100 % ;

- concernant P. gingivalis : le test Evalusite^® présentait une sensibilité de 61,5 % et une spécificité de 100 % lors de comparaison avec les sondes ADN ; une sensibilité de 85,7 % et une spécificité de 91,7 % lors de comparaison avec les cultures bactériennes ;

- concernant P. intermedia, Evalusite^® présentait une sensibilité de 45,4 % et une spécificité de 76,9 % lors de comparaison avec les sondes ADN ; une sensibilité de 58,3 % et une spécificité de 91,7 % lors de comparaison avec les cultures bactériennes.

On peut noter que la spécificité parfaite de 100 % du test Evalusite^® s'explique par la détection nulle de A. actinomycetemcomitans ; et d'autre part que les sensibilités et spécificités du test sont plus faibles lors de la détection de P. intermedia que lors de détection de P. gingivalis.

Discussion

Alors que A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis et P. intermedia sont observés à forte concentration dans des lésions parodontales avancées, des niveaux bas de chacune de ces espèces ont été observés dans des sites sains (^{Socransky et coll., 1991}). Ainsi les expérimentations cliniques sur les rapports des bactéries à la maladie parodontale comportent toujours des seuils bactériens, en quantité ou en pourcentage des bactéries présentes, pour corriger la présence d'un faible nombre de bactéries dans des cas de santé parodontale (^{Bragd et coll., 1987} ; ^{Peros et coll., 1988}).

Un seuil de 10⁴ bactéries a été choisi pour considérer le test positif. Ce seuil a été retenu par plusieurs auteurs (^{Snyder et coll., 1994} ; ^{Boyer et coll., 1996}) pour démontrer la relation entre la présence des bactéries A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis et P. intermedia et la maladie parodontale.

Le choix du nombre de sites prélevés par patient est également un paramètre important pour déterminer la présence d'un micro-organisme chez un patient. ^{Christersson et coll. (1985)} estiment, pour des parodontites de l'adulte et des cultures, qu'il est nécessaire de prélever 25 sites pour obtenir une détection probable de A. actinomycetemcomitans, et de six sites pour P. gingivalis. ^{Gunsolley et coll. (1992)} raisonnent par patient infecté et non par site : le prélèvement groupé de trois à quatre sites semble permettre une détection certaine des bactéries en cas de parodontites destructrices.

Le seuil de détection choisi et le nombre de sites prélevés par patient peut donc influer sur les fréquences d'identification. Dans ces conditions, les fréquences d'identification des 3 espèces bactériennes sur ces 12 patients sont élevées, et comparables aux résultats obtenus par ^{Savitt (1988)} et ^{Loesche et coll. (1992c)} en présence de lésions parodontales avancées et d'un état inflammatoire marqué pour les )cultures et les sondes ADN. Cependant, dans ce travail les sondes ADN, et à moindre titre les cultures, détectent davantage de bactéries que le test Evalusite^®. Les fréquences d'identification respectives de A. actinomycetemcomitans-P. gingivalis-P. intermedia obtenues par ^{Savitt et coll. (1988)} sont de 7 %-19 %-23 % pour les cultures et de 42 %-61 %-72 % pour les sondes ADN. (^{Boyer et coll., 1996)} observent, quant à eux, une fréquence d'identification pour A. actinomycetemcomitans et P. gingivalis de 14 %-43 % pour les cultures et de 15 %-83 % par les sondes ADN. Boyer et coll. (^{Boyer et coll., 1996}), dans des poches + ou - 7 mm, pour des patients atteints de parodontites adultes, ont observé une fréquence d'identification de A. actinomycetemcomitans de 11,4 % pour les cultures et 8,6 % pour le test Evalusite^®, pour P. gingivalis de 45,7 % pour les cultures et 51,4 % pour Evalusite^®, et pour P. intermedia de 31,4 % pour les cultures et 37,1 % par Evalusite^®.

Les cultures sont considérées par Dahlén, en 1993, comme la référence et la similarité des résultats de fréquence d'identification par les cultures et les sondes ADN est très bonne et comparable aux conclusions de ^{Loesche et Hujoel (1992a)}, si l'on considère le . Cependant la plus faible détection des bactéries par les cultures pourrait s'expliquer notamment par le délai de transport critique pour P. gingivalis et P. intermedia (^{Dahlén et coll., 1989} ; ^{van Steenbergen et coll., 1993}), ou par une sous-estimation de A. actinomycetemcomitans et de P. gingivalis par les cultures (^{Loesche et Hujoel, 1992a}). Le manque de corrélation en ce qui concerne les résultats de P. gingivalis (sondes ADN positives et cultures négatives) peut être dû à une détection des bactéries non viables par les sondes ADN. ^{van Steenbergen et coll. (1996)} ont également observé une telle discordance : selon eux, les sondes ADN d'Omnigene présentent souvent des faux positifs (16 %).

Le test immuno-enzymatique n'a jamais pu détecter, dans ce travail, l'A. actinomycetemcomitans et cette sensibilité nulle, en ce qui concerne cette bactérie à fort potentiel pathogène, n'est pas acceptable pour un test (^{Loesche et Hujoel, 1992a}). Ce résultat est en contradiction avec ceux de ^{Snyder et coll. (1994)} qui, sur 26 cas de parodontites adultes et 104 sites analysés par cultures bactériennes et par Evalusite^®, obtiennent des résultats identiques par les deux techniques, pour une concentration bactérienne supérieure à 10⁴ cellules de A. actinomycetemcomitans.

Les spécificités et les sensibilités de détection des trois bactéries obtenues par Evalusite^® sont très inférieures à celles observées par ^{Snyder et coll. (1994)} et ^{Boyer et coll. (1996)} : 90 % de sensibilité et de spécificité, pour quatre sites prélevés par patient, sur des cas de parodontites adultes.

Ces résultats pourraient s'expliquer par un prélèvement de deux sites par patient, et d'autre part parce que nos patients sont des parodontites du jeune adulte. L'absence de détection de A. actinomycetemcomitans par Evalusite^® seulement pourrait être aussi liée aux produits dont nous disposions.

Les associations bactériennes observées dans un même site, notamment de A. actinomycetemcomitans et P. gingivalis permettraient de distinguer, selon ^{Haffajee et Socransky (1994)}, les lésions progressives des lésions non progressives de parodontites sévères. Dans cette étude, cette présence simultanée de plusieurs bactéries a été constatée avec 75 % des patients qui portent deux des trois bactéries suivies et 16,7 % des patients qui portent les trois bactéries. ^{Rodenburg et coll. (1990)} observent, dans des cas de parodontites sévères non traitées, une fréquence d'identification de 97 % pour l'une des trois bactéries A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis ou P. intermedia, de 54 % pour au moins deux des trois bactéries ; et de 14 % pour les trois bactéries.

^{Slots et coll. (1986)} ont observé, dans un groupe de parodontites destructrices de l'adulte, l'association A. actinomycetemcomitans -P. intermedia dans 25 % des lésions progressives.

La détermination de ces associations augmenterait ce risque de perte d'attache dans les parodontites adultes : ^{Wennström et coll. (1987)} observent une progression de 2 mm sur un an dans cinq sites sur les 25 positifs pour ces trois bactéries.

Conclusion

Cette étude n'a pas cherché à démontrer la présence de bactéries par rapport à des formes cliniques de parodontopathies mais souhaitait apprécier la cohérence des informations obtenues par les différents tests. Les cultures bactériennes et les sondes ADN ont donné des résultats cohérents, mais en ce qui concerne les résultats positifs obtenus par les sondes ADN et négatifs par les cultures, une réaction faussement positive des sondes ADN pourrait expliquer cette discordance. Par contre, le test Evalusite^® utilisé, qui présentait l'intérêt de donner des résultats rapides au fauteuil, ne nous paraît pas présenter les caractéristiques suffisantes recherchées dans un test d'identification bactérienne, par rapport aux techniques de références actuelles, représentées par les cultures et les sondes ADN.

Nous tenons à remercier tout particulièrement M. Daniel Ambroise, maître de conférences à l'Université Paris VI, pour ses corrections statistiques.

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